Overview
このビデオでは、ゼブラフィッシュのレオタクシスアッセイについて説明します。この方法は、異なる磁場の影響下で異なる水流量に応答してゼブラフィッシュの配向挙動の測定を含む。
Protocol
1.一次元磁場操作による磁場の設定
- 電源ユニットのスイッチをオンにします(図1A)。
- コイル状トンネルは、レオタクチックプロトコルが実行される場所(セクション3)に配置しますが、水泳装置から切り離したままにします(図1A)。ガウス/テスラメーターに接続された磁気プローブをトンネル内に配置し、トンネルの長軸に沿って選択した磁場値を取得するために必要な電圧を確認します。
注:電磁特性のため、トンネル内の磁場は適度に均一です。これは、プローブを水平および垂直にゆっくりと移動させることで確認できます。 - プローブを外し、フロートンネルを水泳装置に接続します。
- レオタクティクス プロトコル (セクション 3) から始めます。
2. 三次元磁場操作による磁場の設定
- CPU、DAC、およびコイルドライバのスイッチをオンにします(図1B)。
- 3 つの軸 (x、y、z) のそれぞれで、選択した磁場を設定します。
- ヘルムホルツペアセットの中央にトンネルを配置します。
- レオタクティクス プロトコル (セクション 3) から始めます。
3. 流れチャンバーにおけるゼブラフィッシュ・リオタクシスの試験
- 側面と底が隠された2 Lタンクを使用して、フロートンネルに1〜5魚を転送します。
- ポンプの電源を入れ、トンネル内の流量を1.7 cm/sに設定します。
注:このゆっくりと動く水は、トンネル内の水を酸素化し続け、動物の回復を促進します。 - 動物は1時間水泳トンネルに順応してみましょう。
- トンネル内の魚の動作のビデオ録画を開始します。
注:カメラ(Yi 4Kアクションなど)をリモコン(例Bluetooth)で使用し、ビデオを.mpg(30フレーム/s)として保存しました。 - 選択した実験プロトコル(本研究では1.3 cm/s)に従って流量の段階的な増加を開始します。図 2.
注:このプロトコルでは、ゼブラフィッシュの場合は0〜2.8 BL(ボディ長)/sの範囲の低流量を使用しました。これらの流速は、ゼブラフィッシュの連続的な方向の泳ぎを誘発する流速の低い範囲にある(重要な水泳速度の3%-15%[Ucrit])。低流量の使用(ブレットのプロトコルに従って)は、水流の存在下でこの種の特定の行動特性にリンクされています。ゼブラフィッシュは、チャンバーの長軸に沿って泳ぐ傾向があり、水の流れの存在下でも頻繁に回り、上流と下流の両方で泳ぐ傾向があります。この動作は、比較的高速(>8 BL/s)で消え、動物が上流に向けて泳ぎ続けると、水流量(>8 BL/s)の影響を受けます(完全な正のレオタクチック応答)。垂直および横方向の変位は非常にまれです。 -
形態測定室内の魚の写真に動物(性別と全長[TL]、フォーク長[FL]、またはBL)のモーホメトリーを行います。
- 適切な画像を選択します。
- 画像をイメージJで開きます。
- 動物の性別に注意してください(オスのゼブラフィッシュは細くて黄色が多い傾向があり、メスはより丸みを帯びており、青と白の着色を持つ傾向があります)。
- [解析] > [縮尺の設定] をクリックし、トンネルの水平方向の長さ全体を基準として画像のスケールをセンチメートル単位で設定します。
- [解析] > [測定]をクリックし、動物の線長を記録します。
- その体重(BW)を計算します。
注:BW は、以前にラボで構築された sex-FL-BW 関係またはメタデータから計算されます。全体のプロシージャは動物の操作の圧力を避ける。
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Representative Results
図1: 磁場制御のセットアップ. (A) トンネル内の静的な水平磁場の誘導のためのソレノイドを用いた水泳トンネルのレンダリング。ソレノイド(0.83回転/cm)はパワーユニットに接続され、±250 μT(地球の磁場範囲を含む強度範囲)の範囲のフィールドを生成します。右側には、水泳装置に接続されたソレノイドトンネルの写真が表示されます。トンネルはアクリル製で、水の入口に2つの穿張アクリルプレートが置かれて、流れが層に近いように保証します。(B)磁場の制御に設定された3つの直交ヘルムホルツ対の図と写真磁場プローブ、CPU、デジタル-アナログ変換器、およびループを閉じるために使用されるコイルドライバも示されています。コイルの各ペアは、半径(r)30cmの2つの円形コイルとAWG-14銅線のN = 50ターンで構成されています。3軸磁力計(センサー)と選択可能なスケール(±88 μT~± 810 μT)をコイルセットの中心近くに配置します。センサーの範囲は±130 μTまでの範囲に設定されます。これらの値は、代表的な結果に記載された測定値にも使用されました(これらの条件では、公称センサーの分解能は約0.1μTです)。磁場の強度と方向は、デジタルフィードバックシステムで制御されます。センサーは磁界ベクトルの3つの要素(3つの軸)を測定し、対応する誤差信号を抽出する。次いで、単純な積分器フィルタにより補正信号が生成される。デジタル補正信号は、デジタル-アナログ変換器によって電圧に変換され、適切なコイルドライバによって増幅されます。これらの最後の信号は、ヘルムホルツペアを駆動するために使用されます。サンプリング周波数は5 Hzに固定され、ループのユニティゲイン周波数は約0.16Hzです。コイルのヘルムホルツ対の電流が設定されると、全磁界はコイルの中央立方容積(エッジ[L]=10 cm)の平均強度値から2%未満に変化します。測定中、磁界rmsは0.2 μT未満です。セットアップ(パネルAとB)の両方で、磁場を発生させるコイルの電流によって静電場が発生します。最大電流が印加されると、電界の強度は約0.4V/mです。この値は、強度が 1 kV/m の順序である環境に存在する自然または人工的な静的フィールドと比較して無視できます。
図2:ゼブラフィッシュのレオタクティクス閾値を決定するためにテスト中に使用される流量の図。1時間の順応期間の間の流れは、動物に十分な酸素供給を保証するのに十分であった。この設計では、酸素供給は、フロー0の最初の10分のステップであっても、決して限界であると仮定することができます。実際、27°Cの水の酸素含有量は約7.9mg/Lで、動物の酸素消費量は1mg/h(日常的な条件下と低速水泳の両方でゼブラフィッシュの酸素消費量に対する過剰近似量)を有し、流れの欠如の場合、フローがない場合、フリューム中のPo2は動物1匹あたり2%以上減少せず、重要なポラフィッシュを上回る2%以上が残る。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9500 G meter | FWBell | N/A | Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT |
| AD5755-1 | Analog Devices | EVAL-AD5755SDZ | Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter |
| ALR3003D | ELC | 3.76024E+12 | DC Double Regulated power supply |
| BeagleBone Black | Beagleboard.org | N/A | Single Board Computer |
| Coil driver | Home made | N/A | Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI) |
| Helmholtz pairs | Home made | N/A | Coils made with standard AWG-14 wire |
| HMC588L | Honeywell | 900405 | Rev E Digital three-axis magnetometer |
| MO99-2506 | FWBell | 129966 | Single axis magnetic probe |
| Swimming apparatus | M2M Engineering Custom Scientific Equipment | N/A | Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback |
| TECO 278 | TECO | N/A | Thermo-cryostat |
