Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Sebrafish Rheotaxis Assay: En metode for måling av orienteringsadferd som svar på forskjellige vannstrømningshastigheter

Overview

Denne videoen beskriver rheotaxis-analysen i sebrafisk. Metoden innebærer måling av orienteringsadferd av sebrafisk som svar på forskjellige vannstrømningshastigheter under påvirkning av forskjellige magnetiske felt.

Protocol

1.Oppsett av magnetfeltet med endimensjonal magnetfeltmanipulering

  1. Slå på strømenheten (Figur 1A).
  2. Plasser den spolede tunnelen på stedet der den rheotactiske protokollen skal utføres (avsnitt 3), men hold den koblet fra svømmeapparatet (Figur 1A). Plasser en magnetisk sonde koblet til et Gauss/Teslameter inne i tunnelen og kontroller hvilken spenning som er nødvendig for å oppnå den valgte magnetfeltverdien langs tunnelens hovedakse.
    MERK: På grunn av de magnetiske egenskapene til en spole er feltet rimelig ensartet inne i tunnelen; Dette kan kontrolleres ved å bevege sonden langsomt både horisontalt og vertikalt.
  3. Koble fra sonden og koble strømningstunnelen til svømmeapparatet.
  4. Start med den rheotactiske protokollen (avsnitt 3).

2. Oppsett av magnetfeltet med tredimensjonal magnetfeltmanipulering

  1. Slå på CPU-, DAC- og spoledriverne (Figur 1B).
  2. Angi det valgte magnetfeltet på hver av de tre aksene (x, y og z).
  3. Plasser tunnelen i midten av Helmholtz-parene.
  4. Start med den rheotactiske protokollen (avsnitt 3).

3. Test av Sebrafish Rheotaxis i strømningskammeret

  1. Overfør en til fem fisk til strømningstunnelen ved hjelp av en 2 L tank med sidene og bunnen skjult.
  2. Slå på pumpen og sett strømningshastigheten i tunnelen til 1,7 cm/s.
    MERK: Dette saktegående vannet vil holde vannet i tunnelen oksygenert, og det vil lette dyregjenvinningen.
  3. La dyrene akklimatisere seg til svømmetunnelen i 1 time.
  4. Start videoopptaket av fiskens oppførsel i tunnelen.
    MERK: Vi brukte et kamera (f.eks. Yi 4K Action) med fjernkontroll (f.eks. Bluetooth) og lagret videoen som .mpg (30 bilder/s).
  5. Start den trinnvise økningen av strømningshastigheten i henhold til den valgte eksperimentelle protokollen (1,3 cm / s i denne studien; Figur 2).
    MERK: For denne protokollen brukte vi lave strømningshastigheter som for sebrafisk varierer fra 0 til 2,8 BL (kroppslengder)/s. Disse strømningshastighetene er i det nedre spekteret av strømningshastigheter som induserer kontinuerlig orientert svømming i sebrafisk (3%-15% av kritisk svømmehastighet [Ucrit]). Bruken av lave strømningshastigheter (etter Bretts protokoll) er knyttet til de spesifikke atferdsegenskapene til denne arten i nærvær av vannstrømmer. Sebrafisk har en tendens til å svømme langs kammerets hovedakse, snu ofte, selv i nærvær av vannstrøm, og har en tendens til å svømme både oppstrøms og nedstrøms. Denne oppførselen påvirkes av vannstrømningshastigheten, og forsvinner ved relativt høye hastigheter (>8 BL/s), når dyrene kontinuerlig svømmer vendt oppstrøms (full positiv reotactisk respons). Vertikale og tverrgående forskyvninger er svært sjeldne.
  6. Utfør morfometri av dyrene (kjønn og total lengde [TL], gaffellengde [FL] eller BL) på bilder av fisk i et morfometrisk kammer.
    1. Velg riktig bilde.
    2. Åpne bildet i ImageJ.
    3. Legg merke til dyrets kjønn (mannlig sebrafisk er slank og har en tendens til å være gulaktig, mens kvinner er mer avrundet og har en tendens til å ha blå og hvite fargestoffer).
    4. Klikk Analyser > Angi skala, og angi bildeskalaen i centimeter ved hjelp av hele den vannrette lengden på tunnelen som referanse.
    5. Klikk Analyser > Mål og registrer dyrets lineære lengde.
    6. Beregn kroppsvekten (BW).
      MERK: BW beregnes ut fra sex-FL-BW-relasjoner som tidligere er bygget i laboratoriet eller fra metadata. Hele prosedyren unngår manipulasjonsstress på dyrene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
Figur 1: Oppsett for magnetisk feltkontroll. (A) Gjengivelse av svømmetunnelen med en spole for induksjon av et statisk, horisontalt magnetfelt i tunnelen. Spolen (0,83 omdreininger/cm) er koblet til en kraftenhet, og den genererer felt i området ±250 μT (intensitetsområde som inkluderer jordens magnetfeltområde). På høyre side vises et bilde av spoletunnelen som er koblet til svømmeapparatet. Tunnelen er laget av akryl og den har to perforerte akrylplater plassert ved vanninntaket, noe som garanterer at strømmen er nær laminær. (B) Diagram og bilde av de tre ortogonale Helmholtz-parene som er satt for kontroll av magnetfeltet i det geomagnetiske spekteret av intensiteter. Magnetfeltsonden, CPU-en, den digitale til analoge omformeren og spoledriverne som brukes til å lukke løkken, vises også. Hvert par spoler består av to sirkulære spoler med en radius (r) på 30 cm og N = 50 svinger av AWG-14 kobberledninger. Et magnetometer med tre akser (sensor) med valgbar skala (± 88 μT til ± 810 μT) plasseres nær midten av spolesettet. Sensorområdet er satt til verdier som spenner til ±130 μT. Disse verdiene ble også brukt til målingene beskrevet i de representative resultatene (under disse forholdene er den nominelle sensoroppløsningen ca. 0,1 μT). Intensiteten og retningen til magnetfeltet styres med et digitalt tilbakemeldingssystem. Sensoren måler de tre komponentene i magnetfeltvektoren (de tre aksene), og de tilsvarende feilsignalene trekkes ut. Deretter genereres korreksjonssignalene av et enkelt integratorfilter. De digitale korreksjonssignalene omdannes til spenning av en digital-til-analog omformer og forsterkes av en passende spoledriver. Disse siste signalene brukes til å kjøre Helmholtz-parene. Samplingsfrekvensen er festet til 5 Hz og enhetens forsterkningsfrekvens for løkkene er ca. 0,16 Hz. Når strømmene i Helmholtz-parene på spolene er satt, varierer det totale magnetfeltet mindre enn 2% fra gjennomsnittsintensitetsverdien i det sentrale kubikkvolumet (med kant [L] = 10 cm) av spolene. Under målingene er magnetfeltet rms mindre enn 0, 2 μT. I både oppsettene (panel A og B) genereres et statisk elektrisk felt av strømmen i spolene som produserer magnetfeltet. Intensiteten til det elektriske feltet er ca. 0,4 V/m når maksimal strøm påføres; Denne verdien er ubetydelig sammenlignet med naturlige eller kunstige statiske felt som finnes i miljøet hvis intensitet er i 1 kV/m.

Figure 2
Figur 2: Diagram over strømningshastighetene som brukes under testene for å bestemme den reeotactiske terskelen til sebrafisk. Strømmen i løpet av 1 t akklimatiseringsperioden var nok til å garantere tilstrekkelig oksygentilførsel til dyrene. Det kan antas at oksygentilførsel med dette designet aldri er en grense, selv i de første 10 minutters trinnet med strømning 0. Faktisk, med et oksygeninnhold av vann ved 27 °C på ca. 7,9 mg/l og et oksygenforbruk for dyr på 1 mg/t.g (en overskytende tilnærming for sebrafisk oksygenforbruk både under rutinemessige forhold og ved lavhastighetssvømming), er det mulig å beregne det, i fravær av strømning vil Po2 i flumet ikke redusere mer enn 2% per dyr, og forbli godt over den kritiske Po2 (ca. 40 torr for sebrafisk).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
9500 G meter  FWBell N/A Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT
AD5755-1  Analog Devices EVAL-AD5755SDZ Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D  ELC 3.76024E+12 DC Double Regulated power supply
BeagleBone  Black  Beagleboard.org  N/A Single Board Computer
Coil driver  Home made  N/A Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs  Home made  N/A Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L  Honeywell  900405 Rev E Digital three-axis magnetometer
MO99-2506  FWBell  129966 Single axis magnetic probe
Swimming apparatus M2M Engineering Custom Scientific Equipment  N/A Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278 TECO   N/A Thermo-cryostat

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Tom verdi Problem
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter