Ensayo de renaotaxis de pez cebra: un método para medir el comportamiento de orientación en respuesta a los diferentes caudales de agua

Overview

Este video describe el ensayo de rheotaxis en el pez cebra. El método implica la medición del comportamiento de orientación del pez cebra en respuesta a diferentes caudales de agua bajo la influencia de diferentes campos magnéticos.

Protocol

1.Configuración del campo magnético con la manipulación de campo magnético unidimensional

1. Encienda la unidad de alimentación (Figura 1A).
2. Coloque el túnel enrollado en el lugar donde se llevará a cabo el protocolo reeotactico (sección 3) pero manténgalo desconectado del aparato de natación(Figura 1A). Coloque una sonda magnética conectada con un Gauss/Teslameter dentro del túnel y verifique qué voltaje es necesario para obtener el valor de campo magnético elegido a lo largo del eje principal del túnel.
   NOTA: Debido a las propiedades magnéticas de un solenoide, el campo es razonablemente uniforme dentro del túnel; esto se puede comprobar moviendo lentamente la sonda tanto horizontal como verticalmente.
3. Desconecte la sonda y conecte el túnel de flujo al aparato de natación.
4. Comience con el protocolo reeotactico (sección 3).

2. Configuración del campo magnético con la manipulación tridimensional del campo magnético

1. Encienda los controladores cpu, DAC y bobina (figura 1B).
2. Establezca el campo magnético elegido en cada uno de los tres ejes (x, y y z).
3. Coloque el túnel en el centro del conjunto de pares Helmholtz.
4. Comience con el protocolo reeotactico (sección 3).

3. Prueba del rótax de pez cebra en la cámara de flujo

1. Transfiera de uno a cinco peces al túnel de flujo utilizando un tanque de 2 L con los lados y el fondo oscurecido.
2. Encienda la bomba y ajuste el caudal del túnel a 1,7 cm/s.
   NOTA: Esta agua de movimiento lento mantendrá el agua en el túnel oxigenada y facilitará la recuperación de los animales.
3. Deja que los animales se aclimatan al túnel de natación durante 1 h.
4. Inicie la grabación de vídeo del comportamiento de los peces en el túnel.
   NOTA: Utilizamos una cámara (por ejemplo, Yi 4K Action) con control remoto (por ejemplo, Bluetooth) y guardamos el vídeo como .mpg (30 fotogramas/s).
5. Inicie el aumento escalonado del caudal de acuerdo con el protocolo experimental elegido (1,3 cm/s en este estudio; Figura 2).
   NOTA: Para este protocolo, utilizamos bajos caudales que, para el pez cebra, oscilan entre 0 y 2,8 BL (longitudes corporales)/s. Estas velocidades de flujo se encuentran en el rango más bajo de caudales que inducen la natación orientada continua en peces cebra (3%-15% de la velocidad crítica de natación [U_crit]). El uso de bajos caudales (siguiendo el protocolo de Brett) está vinculado a las características conductuales específicas de esta especie en presencia de corrientes de agua. Los peces cebra tienden a nadar a lo largo del eje principal de la cámara, girando con frecuencia, incluso en presencia de flujo de agua, y tienden a nadar tanto aguas arriba como aguas abajo. Este comportamiento se ve afectado por el caudal de agua, desapareciendo a velocidades relativamente altas (>8 BL/s), cuando los animales nadan continuamente mirando hacia arriba (respuesta reepotáctica positiva completa). Los desplazamientos verticales y transversales son muy raros.
6. Realizar morphometry de los animales (sexo y longitud total [TL], longitud de tenedor [FL], o BL) en imágenes de peces en una cámara morfométrica.
   1. Seleccione la imagen adecuada.
   2. Abra la imagen en ImageJ.
   3. Tome nota del sexo del animal (los peces cebra macho son delgados y tienden a ser amarillentos, mientras que las hembras son más redondeadas y tienden a tener colorantes azules y blancos).
   4. Haga clic en Analizar > Establecer escala y establezca la escala de la imagen en centímetros, utilizando toda la longitud horizontal del túnel como referencia.
   5. Haga clic en Analizar > Medir y registre la longitud lineal del animal.
   6. Calcular su peso corporal (BW).
      NOTA: BW se calcula a partir de relaciones sexo-FL-BW previamente construidas en el laboratorio o a partir de metadatos. Todo el procedimiento evita el estrés por manipulación en los animales.

Representative Results

Figura 1: Configuración para el control del campo magnético. (A) Renderizado del túnel de natación con un solenoide para la inducción de un campo magnético estático y horizontal dentro del túnel. El solenoide (0,83 vueltas/cm) está conectado a una unidad de potencia y genera campos en el rango de ±250 μT (rango de intensidad que incluye el rango de campo magnético de la Tierra). En el lado derecho, se muestra una foto del túnel solenoide conectado al aparato de natación. El túnel está hecho de acrílico y tiene dos placas acrílicas perforadas colocadas en la entrada de agua, que garantizan que el flujo esté cerca del laminar. (B) Diagrama y foto de los tres pares ortogonales de Helmholtz establecidos para el control del campo magnético en el rango geomagnético de intensidades. También se muestran la sonda de campo magnético, la CPU, el convertidor digital a analógico y los controladores de bobina utilizados para cerrar el bucle. Cada par de bobinas se compone de dos bobinas circulares con un radio (r) de 30 cm y N = 50 vueltas de alambres de cobre AWG-14. Se coloca un magnetómetro de tres ejes (sensor) con escala seleccionable (± de 88 μT a ± 810 μT) cerca del centro del juego de bobinas. El rango del sensor se establece en valores que van a ±130 μT. Estos valores también se utilizaron para las mediciones descritas en los resultados representativos (en estas condiciones, la resolución nominal del sensor es de aproximadamente 0,1 μT). La intensidad y la dirección del campo magnético se controlan con un sistema de retroalimentación digital. El sensor mide los tres componentes del vector de campo magnético (los tres ejes) y se extraen las señales de error correspondientes. A continuación, las señales de corrección son generadas por un filtro integrador simple. Las señales de corrección digital se convierten al voltaje mediante un convertidor digital a analógico y se amplifican mediante un controlador de bobina adecuado. Estas últimas señales se utilizan para conducir los pares Helmholtz. La frecuencia de muestreo se fija a 5 Hz y la frecuencia de ganancia de unidad de los bucles es de aproximadamente 0,16 Hz. Una vez que se establecen las corrientes en los pares Helmholtz de las bobinas, el campo magnético total varía menos del 2% de su valor medio de intensidad en el volumen cúbico central (con borde [L] = 10 cm) de las bobinas. Durante las mediciones, el campo magnético rms es inferior a 0,2 μT. Tanto en las configuraciones (paneles A y B)se genera un campo eléctrico estático por la corriente en las bobinas que producen el campo magnético. La intensidad del campo eléctrico es de aproximadamente 0,4 V/m cuando se aplica la corriente máxima; este valor es insignificante en comparación con los campos estáticos naturales o artificiales presentes en el entorno cuya intensidad es del orden de 1 kV/m.

Figura 2: Diagrama de los caudales utilizados durante las pruebas para determinar el umbral reepotáctico del pez cebra. El flujo durante el período de aclimatación de 1 h fue suficiente para garantizar un suministro adecuado de oxígeno a los animales. Se puede suponer que, con este diseño, el suministro de oxígeno nunca es un límite, incluso en el primer paso de 10 minutos con el flujo 0. De hecho, con un contenido de oxígeno de agua a 27 °C de aproximadamente 7,9 mg/L y un consumo de oxígeno animal de 1 mg/h.g (una aproximación excesiva para el consumo de oxígeno de pez cebra tanto en condiciones rutinarias como a baja velocidad de natación), es posible calcularlo, a falta de caudal, el Po₂ en la flauta no disminuirá más de un 2% por animal, permaneciendo muy por encima del Po₂ crítico (unos 40 torr para el pez cebra).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9500 G meter	FWBell	N/A	Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D	ELC	3.76024E+12	DC Double Regulated power supply
BeagleBone  Black	Beagleboard.org	N/A	Single Board Computer
Coil driver	Home made	N/A	Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs	Home made	N/A	Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L	Honeywell	900405	Rev E Digital three-axis magnetometer
MO99-2506	FWBell	129966	Single axis magnetic probe
Swimming apparatus	M2M Engineering Custom Scientific Equipment	N/A	Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278	TECO	N/A	Thermo-cryostat