Zebrafisk Rheotaxis-analys: En metod för att mäta orienteringsbeteende som svar på olika vattenflöden

Overview

Denna video beskriver rheotaxis analys i zebrafisk. Metoden innebär mätning av zebrafiskens orienteringsbeteende som svar på olika vattenflöden under påverkan av olika magnetfält.

Protocol

1.Uppsättning av magnetfältet med endimensionell magnetisk fältmanipulation

1. Slå på effektenheten (bild 1A).
2. Placera den spolade tunneln på den plats där det reotaktiska protokollet ska utföras (avsnitt 3) men håll den frånkopplad från simapparaten (figur 1A). Placera en magnetisk sond ansluten till en Gauss/Teslameter inuti tunneln och kontrollera vilken spänning som är nödvändig för att erhålla det valda magnetiska fältvärdet längs tunnelns huvudaxel.
   OBS: På grund av solenoidens magnetiska egenskaper är fältet någorlunda enhetligt inne i tunneln; Detta kan kontrolleras genom att långsamt flytta sonden både horisontellt och vertikalt.
3. Koppla bort sonden och anslut flödestunneln till simapparaten.
4. Börja med det reotaktiska protokollet (avsnitt 3).

2. Magnetfältsuppsättning med tredimensionell magnetisk fältmanipulation

1. Slå på cpu-, DAC- och spoledrivrutinerna (bild 1B).
2. Ställ in det valda magnetfältet på var och en av de tre axlarna (x, y och z).
3. Placera tunneln i mitten av Helmholtz-paruppsättningen.
4. Börja med det reotaktiska protokollet (avsnitt 3).

3. Test av zebrafisken Rheotaxis i flödeskammaren

1. Överför en till fem fiskar till flödestunneln med en 2 L-tank med sidorna och botten skymd.
2. Slå på pumpen och ställ in flödeshastigheten i tunneln på 1,7 cm/s.
   OBS: Detta långsamma vatten kommer att hålla vattnet i tunneln syresatt och det kommer att underlätta djurens återhämtning.
3. Låt djuren acklimatisera sig till simtunneln i 1 timme.
4. Starta videoinspelningen av fiskens beteende i tunneln.
   OBS: Vi använde en kamera (t.ex. Yi 4K Action) med fjärrkontroll (t.ex. Bluetooth) och sparade videon som .mpg (30 bilder/s).
5. Starta den stegvisa ökningen av flödeshastigheten enligt det valda experimentella protokollet (1,3 cm/s i denna studie; Figur 2).
   OBS: För detta protokoll använde vi låga flödeshastigheter som för zebrafisk varierar från 0 till 2,8 BL (kroppslängder)/s. Dessa flödeshastigheter är i det lägre intervallet av flödeshastigheter som inducerar kontinuerlig orienterad simning i zebrafisk (3-15% av kritisk_{simhastighet [U-kritiska}]). Användningen av låga flödeshastigheter (enligt Bretts protokoll) är kopplad till de specifika beteendeegenskaperna hos denna art i närvaro av vattenströmmar. Zebrafisk tenderar att simma längs kammarens stora axel och vrida ofta, även i närvaro av vattenflöde, och tenderar att simma både uppströms och nedströms. Detta beteende påverkas av vattenflödet och försvinner i relativt höga hastigheter (>8 BL/s), när djuren kontinuerligt simmar vänd uppåt (fullt positivt reotactic svar). Vertikala och tvärgående förskjutningar är mycket sällsynta.
6. Utför morfologi av djuren (kön och total längd [TL], gaffellängd [FL], eller BL) på bilder av fisk i en morfometrisk kammare.
   1. Välj lämplig bild.
   2. Öppna bilden i BildJ.
   3. Notera djurets kön (manliga zebrafiskar är smala och tenderar att vara gulaktiga, medan kvinnor är mer rundade och tenderar att ha blå och vita färgningar).
   4. Klicka på Analysera > Ställ in skala och ställ in bildens skala i centimeter med hela tunnelns vågräta längd som referens.
   5. Klicka på Analysera > Mät och registrera djurets linjära längd.
   6. Beräkna dess kroppsvikt (BW).
      OBS: BW beräknas utifrån sex-FL-BW-relationer som tidigare byggts i labbet eller från metadata. Hela proceduren undviker manipulationsstress på djuren.

Representative Results

Bild 1: Inställning för magnetisk fältkontroll. (A) Återgivning av simtunneln med en solenoid för induktion av ett statiskt, horisontellt magnetfält i tunneln. Solenoiden (0,83 varv/cm) är ansluten till en kraftenhet och genererar fält inom intervallet ±250 μT (intensitetsområde som inkluderar jordens magnetfältsområde). Till höger visas ett foto av solenoidtunneln som är ansluten till simapparaten. Tunneln är gjord av akryl och har två perforerade akrylplattor placerade vid vatteninloppet, vilket garanterar att flödet är nära laminar. B)Diagram och foto av de tre orthogonala Helmholtz-paren som ställts in för kontroll av magnetfältet i det geomagnetiska intensitetsområdet. Magnetfältsonden, CPU:n, digital-till-analog-omvandlaren och de spoledrivrutiner som används för att stänga slingan visas också. Varje par spolar består av två cirkulära spolar med en radie (r) på 30 cm och N = 50 varv AWG-14 koppartrådar. En magnetometer med tre axlar (sensor) med valbar skala (± 88 μT till ± 810 μT) placeras nära mitten av spoleuppsättningen. Sensorområdet är inställt på värden som sträcker sig ±130 μT. Dessa värden användes också för de mätningar som beskrivs i de representativa resultaten (under dessa förhållanden är den nominella sensorupplösningen ca 0,1 μT). Magnetfältets intensitet och riktning styrs med ett digitalt återkopplingssystem. Sensorn mäter de tre komponenterna i magnetfältsvektorn (de tre axlarna) och motsvarande felsignaler extraheras. Sedan genereras korrigeringssignalerna av ett enkelt integratorfilter. De digitala korrigeringssignalerna omvandlas till spänning av en digital-till-analog omvandlare och förstärks av en lämplig spoledrivrutin. De sista signalerna används för att driva Helmholtz-paren. Provtagningsfrekvensen är fastsatt på 5 Hz och slingornas enhetsvinstfrekvens är ca 0,16 Hz. När strömmarna i Helmholtz-paren av spolarna är inställda varierar det totala magnetfältet mindre än 2% från dess medelintensitetsvärde i den centrala kubikvolymen (med kant [L] = 10 cm) av spolarna. Under mätningarna är magnetfältet rms mindre än 0,2 μT. I båda inställningarna (panelerna A och B) genereras ett statiskt elektriskt fält av strömmen i spolarna som producerar magnetfältet. Det elektriska fältets intensitet är ca 0,4 V/m när den maximala strömmen appliceras. Detta värde är försumbart jämfört med naturliga eller konstgjorda statiska fält i miljön vars intensitet är i storleksordningen 1 kV/m.

Figur 2: Diagram över de flödeshastigheter som använts under testerna för att fastställa zebrafiskens reotaktiska tröskel. Flödet under acklimatiseringsperioden på 1 timme var tillräckligt för att garantera en tillräcklig syretillförsel till djuren. Man kan anta att syretillförseln med denna design aldrig är en gräns, inte ens under det första steget på 10 minuter med flöde 0. I själva tiden har jag faktiskt med en syrehalt av vatten vid 27 °C på ca 7,9 mg/L och en syreförbrukning på 1 mg/h.g (en överskott av approximation för konsumtion av zebrafisksyrgas både under rutinförhållanden och vid simning med låg hastighet), är det möjligt att beräkna att Po₂ i flumen inte kommer att minska mer än 2 % per djur och förbli långt över den kritiska Po₂ (ca 40 torr för zebrafisk).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9500 G meter	FWBell	N/A	Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D	ELC	3.76024E+12	DC Double Regulated power supply
BeagleBone  Black	Beagleboard.org	N/A	Single Board Computer
Coil driver	Home made	N/A	Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs	Home made	N/A	Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L	Honeywell	900405	Rev E Digital three-axis magnetometer
MO99-2506	FWBell	129966	Single axis magnetic probe
Swimming apparatus	M2M Engineering Custom Scientific Equipment	N/A	Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278	TECO	N/A	Thermo-cryostat