A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

Bron: Steele, W.B., et al. Experimenteel protocol voor het onderzoeken van gedragsresponsprofielen bij larvale vissen: toepassing op het neurostimulant cafeïne. J.Vis. Exp. (2018).

Deze video beschrijft de fotomotorische responstest van zebravissen en dikkopminnowlarven met behulp van een geautomatiseerde trackingsoftware. Het protocol meet de gedragsrespons van de larvevis na een plotselinge verandering in de lichtomstandigheden.

Protocol

1. Kalibratie van videotrackingparameters Stel voorafgaand aan gedragsmetingen observatie- en kalibratieparameters in de videotracksoftware in (zie Tabel met materialen). Plaats een putplaat in de opnamekamer met ten minste 1 larvevis in een individuele put. Gebruik de plaat en de bijbehorende vis als voorstellingen om kalibratieparameters in te stellen. Klik in de videotracksoftware op “Bestand | Protocol genereren”, waarmee een dialoogvenster ‘wizard voor het maken van protocollen’ wordt geopend. Voer in het veld “Aantal locaties” het aantal individuele putten van de putplaat in en klik vervolgens op “OK”. Klik boven aan het scherm op “Bekijk | Full Screen”, wat het systeem zal vragen om een overhead cameraweergave van de putplaat weer te geven. Klik op het pictogram “Gebieden tekenen”, dat wordt weergegeven als drie veelkleurige vormen. Selecteer rechts van het weergavegebied van de putplaat het cirkelpictogram in het veld met het label “Gebieden”. Gebruik de cursor om het cirkelvormige videotrackinggebied linksboven in de putplaat af te baketen. Selecteer “Rechtsboven markeren” en schets vervolgens het weergavegebied van de rechterbovenhoek goed. Selecteer vervolgens “Onderste markering” om de rechterbenedenafdruk goed te schetsen.OPMERKING: Na het tekenen van de cirkelvormige omtrek moet de positie waarschijnlijk worden aangepast.  Als u de positie van de omtrek wilt aanpassen, klikt u op “selecteren” en gebruikt u vervolgens de cursor om het geschetste gebied te verplaatsen. Overzichten kunnen ook worden gerepliceerd door op “Kopiëren” en vervolgens op “Plakken” te klikken. Nadat de gebieden linksboven, rechtsboven en rechtsonder goed volggebieden zijn gedefinieerd, klikt u op “Bouwen” om de software te vragen de weergavegebieden van de resterende putten automatisch af te bakenen. Klik in het gebied met het label “Kalibratie” op “Schaal tekenen”. Gebruik de cursor om een horizontale lijn over de plaat te tekenen. Zodra de lijn is getrokken, verschijnt er een dialoogvenster met het label “Kalibratiemeting”. Voer de lengte van de putplaat in en klik op “OK”. Sluit de tekenmanager af door op het pictogram “Gebieden tekenen” te klikken. Klik op het pictogram “Tegels”.  Markeer met de cursor alle vakken die op het weergavescherm worden weergegeven, zodat elk vak groen is.OPMERKING: Het pictogram Tegels wordt weergegeven als een groep van zes afzonderlijke kleine vierkantjes “Klik op Weergave| Volledig scherm”.  Klik rechts van het weergavegebied van de plaat op “Bkg” in het vak met het label “Detectiedrempel”. Gebruik de drempel aanpassingsbalk om de drempel waarde voor pixel detectie in te stellen. Zodra de juiste pixeldetectiedrempel is geselecteerd, klikt u op ‘Toepassen op groep’.OPMERKING: Dit protocol stelt de detectiedrempel in op 13 in de zwarte modus voor zebraviswaarnemingen en op 110 in transparante modus voor dikkopminnow-waarnemingen. Voer in het vak met het label “Bewegingsdrempel” de gewenste parameters voor het volgen van bewegingssnelheden in. Zodra snelheidsparameters zijn ingesteld, klikt u op “Toepassen op groep”.OPMERKING: Dit protocol stelt kleine/grote bewegingen in op 20 mm/s en inactieve/kleine bewegingen op 5 mm/s. Deze selecties programmeren de software om de beweging van larvale vissen op drie verschillende snelheidsniveaus te volgen: inactief (invriezen) = 20 mm/s. Klik op “Parameters | Protocolparameters” in het vervolgkeuzemenu. Selecteer in het dialoogvenster het tabblad “Tijd”. Voer de observatietijd en de integratietijd in. Nadat de parameters zijn ingevoerd, klikt u op “Ok”. Om de licht/donkere fotoperiodetijden en lichtintensiteit voor elke fotoperiode in te stellen, opent u het dialoogvenster met de instellingen van het lichtstuurprogramma door “Licht rijden” te selecteren in het vervolgkeuzemenu “Parameters”.OPMERKING: Zie protocolvideo voor het instellen van meerdere licht-donker fotoperioden. Nadat de parameters voor videotracking zijn ingesteld, slaat u het observatieprotocol op.OPMERKING: Dit protocol observeert het gedrag van vissen gedurende een periode van 50 minuten die een acclimatisatiefase van 10 minuten omvat, gevolgd door 4 veranderende licht/donkerfasen bestaande uit twee lichtperioden van 10 minuten en twee donkere perioden van 10 minuten. De integratietijd is ingesteld om gedrag te meten voor elke minuut van de gedrags proef van 50 minuten. 2. Observatie van larvale vissen locomotorisch en fotomotorisch gedrag Plaats de putplaat met experimentele vissen in de gedragsopnamekamer. Open in de videotrackingsoftware het trackingprotocol dat in de volgende stap is ontwikkeld. Controleer in de videotrackingviewer of alle larven zichtbaar zijn op het computerscherm, of er slechts één individuele larve in elke put aanwezig is en of individuele putten zijn uitgelijnd binnen de observatiegebieden die zijn gedefinieerd in stap 1.1.5 en 1.1.6. Klik op “Experiment | Uitvoeren”.OPMERKING: Het systeem zal de gebruiker vragen om een naam en locatie op te geven om de observatiegegevens op te slaan. Zodra de naam en de opslaglocatie van de observatiegegevens zijn opgegeven, klikt u op het pictogram “Meerdere livebeelden” om alle vooraf gedefinieerde weergavegebieden te markerenOPMERKING: Dit pictogram bevindt zich bovenaan het computerscherm en verschijnt als een vak verdeeld in vier kleinere vierkanten. Als u op dit pictogram klikt, worden alle vooraf gedefinieerde weergavegebieden weergegeven. Sluit het paneel van de opnamekamer en klik op “Achtergrond | Start” op de computermonitor.

Materials

48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers