Analyse de réponse photomotrice : Méthode pour mesurer la réponse comportementale du poisson zèbre larvaire à un changement soudain dans l’état d’éclairage

Overview

Cette vidéo décrit l’analyse de réponse photomotrice des larves de poisson zèbre et de ménés à tête grasse à l’aide d’un logiciel de suivi automatisé. Le protocole mesure la réponse comportementale des poissons larvaux à la suite d’un changement soudain dans l’état d’éclairage.

Protocol

1. Étalonnage des paramètres de suivi vidéo

1. Avant les mesures comportementales, définissez les paramètres d’observation et d’étalonnage dans le logiciel de suivi vidéo (voir tableau des matériaux).
   1. Placer une plaque de puits dans la chambre d’enregistrement avec au moins 1 poisson larvaire dans un puits individuel. Utilisez la plaque et les poissons associés comme représentations pour définir des paramètres d’étalonnage.
   2. Dans le logiciel de suivi vidéo, cliquez sur « File | Générer protocole », qui ouvrira un « assistant de création de protocole » boîte de dialogue. Dans le champ « Compte de localisation », entrez le nombre de puits individuels de la plaque de puits, puis cliquez sur « OK ».
   3. En haut de l’écran, cliquez sur « Voir | plein écran », ce qui incitera le système à afficher une vue aérienne de la plaque de puits.
   4. Cliquez sur l’icône « Zones de tirage », qui apparaît sous forme de trois formes multicolores. À droite de la zone d’observation des plaques de puits, sélectionnez l’icône du cercle dans le champ étiqueté « Zones ».
   5. Utilisez le curseur pour délimifier la zone circulaire de suivi vidéo en haut à gauche bien de la plaque de puits. Sélectionnez « Top-Right Mark » puis définissez bien la zone d’observation du haut à droite. Ensuite, sélectionnez « Bottom Mark » pour bien décrire le bas à droite.
      REMARQUE: Après avoir dessiné le contour circulaire, sa position devra probablement être ajustée.  Pour ajuster la position du contour, cliquez sur « sélectionnez » puis utilisez le curseur pour déplacer la zone décrite. En outre, les contours peuvent être répliqués en cliquant sur "Copie" puis "Coller« .
   6. Une fois que les zones de suivi des puits en haut à gauche, en haut à droite et en bas à droite ont été définies, cliquez sur « Construire » pour inciter le logiciel à délimité automatiquement les zones d’observation des puits restants.
   7. Dans la zone étiquetée « Étalonnage », cliquez sur « Dessiner l’échelle ». Utilisez le curseur pour tracer une ligne horizontale à travers la plaque. Une fois la ligne tracée, une boîte de dialogue étiquetée « Mesure d’étalonnage » apparaîtra. Entrez la longueur de la plaque de puits et cliquez sur « OK ».
   8. Quittez le gestionnaire de dessin en cliquant sur l’icône « Zones de tirage ».
   9. Cliquez sur l’icône « Tuiles ».  À l’aide du curseur, mettez en surbrillance toutes les cases qui apparaissent sur l’écran de visualisation de sorte que chaque boîte soit verte.
      REMARQUE: L’icône Tiles apparaît comme un groupe de six petits carrés individuels
   10. « Cliquez sur Afficher| Plein écran ».  À droite de la zone d’observation de la plaque, cliquez sur « Bkg » dans la case étiquetée « Seuil de détection ». Utilisez la barre de réglage du seuil pour définir le seuil de détection des pixels. Une fois que le seuil de détection des pixels approprié est sélectionné, cliquez sur « Appliquer au Groupe ».
       REMARQUE: Ce protocole fixe le seuil de détection à 13 en mode noir pour les observations du poisson zèbre et à 110 en mode transparent pour les observations de ménés à tête grasse.
   11. Dans la boîte étiquetée « Seuil de mouvement », entrez les paramètres de suivi de vitesse de déplacement souhaités. Une fois que les paramètres de vitesse sont définis, cliquez sur « Appliquer au Groupe ».
       REMARQUE: Ce protocole fixe les petits/grands mouvements à 20 mm/s et les mouvements inactifs/petits à 5 mm/s. Ces sélections programment le logiciel pour suivre le mouvement des poissons larvaux à trois niveaux de vitesse différents : inactif (congélation) = <5 mm/s, petit (croisière) = 5-20 mm/s, et grand (éclatement) = >20 mm/s.
   12. Cliquez sur « Paramètres | Paramètres de protocole » du menu drop-down. Dans la boîte de dialogue, sélectionnez l’onglet « Temps ». Entrez le temps d’observation et le temps d’intégration. Après la saisie des paramètres, cliquez sur « Ok ».
   13. Pour définir les temps de photopériod lumière/obscurité et l’intensité lumineuse de chaque photopériod, ouvrez la boîte de dialogue des réglages du conducteur léger en sélectionnant la « conduite légère » dans le menu « Paramètres ».
       REMARQUE: Voir la vidéo du protocole pour définir plusieurs photopériodes sombres et lumineuses.
   14. Une fois que les paramètres de suivi vidéo ont été définis, enregistrez le protocole d’observation.
       REMARQUE: Ce protocole observe le comportement des poissons sur une période de 50 minutes qui comprend une phase d’acclimation de 10 min suivie de 4 phases de modification de la lumière et de l’obscurité composées de deux périodes de lumière de 10 min et de deux périodes sombres de 10 min. Le temps d’intégration est défini pour mesurer le comportement pour chaque minute de l’essai comportemental de 50 min.

2. Observation du comportement locomoteur et photomoteur des poissons larvaux

1. Placer la plaque de puits contenant des poissons expérimentaux dans la chambre d’enregistrement comportementale.
2. Dans le logiciel de suivi vidéo, ouvrez le protocole de suivi développé à l’étape suivante.
3. Dans la visionneuse de suivi vidéo, vérifiez que toutes les larves sont visibles sur l’écran de l’ordinateur, qu’une seule larve individuelle est présente dans chaque puits et que les puits individuels sont alignés dans les zones d’observation définies dans les étapes 1.1.5 et 1.1.6.
4. Cliquez sur « Expérience | Exécuter ».
   REMARQUE: Le système invitera l’utilisateur à fournir un nom et un emplacement pour enregistrer les données d’observation.
5. Une fois que le nom et l’emplacement des données d’observation ont été spécifiés, cliquez sur l’icône « Plusieurs images en direct » pour mettre en surbrillance toutes les zones de visualisation prédéfinies
   REMARQUE: Cette icône est située en haut de l’écran de l’ordinateur et apparaît comme une boîte divisée en quatre petits carrés. En cliquant sur cette icône, vous mettrez en évidence toutes les zones de visualisation prédéfines.
6. Fermez le panneau de la chambre d’enregistrement et cliquez sur « Contexte | Démarrer » sur le moniteur d’ordinateur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers