Overview
Este vídeo descreve o ensaio de resposta fotomotor de zebrafish e larvas de peixinho-gordo usando um software de rastreamento automatizado. O protocolo mede a resposta comportamental dos peixes larvais após uma mudança brusca no estado de iluminação.
Protocol
1. Calibração dos parâmetros de rastreamento de vídeo
- Antes das medidas comportamentais, defina parâmetros de observação e calibração no software de faixa de vídeo (ver Tabela de Materiais).
- Coloque uma placa de poço na câmara de gravação com pelo menos 1 peixe larval em um poço individual. Use a placa e o peixe associado como representações para definir parâmetros de calibração.
- No software de faixa de vídeo, clique em "Arquive | Gerar Protocolo", que abrirá uma caixa de diálogo "assistente de criação de protocolo". No campo "Contagem de localização", digite o número de poços individuais da placa do poço e clique em "OK".
- Na parte superior da tela, clique em "Exibir | Tela Cheia", que levará o sistema a exibir uma visão de câmera aérea da placa do poço.
- Clique no ícone "Desenhar áreas", que aparece como três formas multicoloridas. À direita da área de visualização da placa de poço, selecione o ícone de círculo no campo rotulado de "Áreas".
- Use o cursor para delinear a área de rastreamento de vídeo circular no poço superior esquerdo da placa do poço. Selecione "Marca superior direita" e, em seguida, delineie bem a área de visualização do canto superior direito. Em seguida, selecione "Marca inferior" para delinear bem o canto inferior direito.
NOTA: Após o desenho do contorno circular, é provável que sua posição precise ser ajustada. Para ajustar a posição do contorno, clique em "selecionar" e, em seguida, use o cursor para mover a área delineada. Além disso, os contornos podem ser replicados clicando em "Copiar" e, em seguida, "Colar". - Depois que as áreas de rastreamento superior esquerdo, superior direito e inferior direito foram definidas, clique em "Build" para solicitar que o software delineie automaticamente as áreas de visualização dos poços restantes.
- Na área rotulada "Calibração", clique em "Escala de desenho". Use o cursor para desenhar uma linha horizontal através da placa. Uma vez que a linha é desenhada, uma caixa de diálogo rotulada como "Medição de calibração" aparecerá. Digite o comprimento da placa do poço e clique em "OK".
- Saia do gerenciador de desenho clicando no ícone "Desenhar áreas".
- Clique no ícone "Ladrilhos". Usando o cursor, destaque todas as caixas que aparecem na tela de visualização para que cada caixa fique verde.
NOTA: O ícone de telhas aparece como um grupo de seis quadrados pequenos individuais - "Clique em Exibir| Tela cheia". À direita da área de visualização da placa, clique em "Bkg" na caixa rotulada "Limiar de Detecção". Use a barra de ajuste de limiar para definir o limiar de detecção de pixels. Uma vez que o limiar de detecção de pixels apropriado seja selecionado, clique em "Aplicar ao grupo".
NOTA: Este protocolo define o limiar de detecção em 13 no modo preto para observações de zebrafish e em 110 no modo transparente para observações de peixinho-cabeça-de-gordura. - Na caixa rotulada "Limiar de movimento", digite os parâmetros de rastreamento de velocidade de movimento desejados. Uma vez definidos os parâmetros de velocidade, clique em "Aplicar ao grupo".
NOTA: Este protocolo define movimentos pequenos/grandes em movimentos de 20 mm/s e movimentos inativos/pequenos a 5 mm/s. Essas seleções programam o software para rastrear o movimento dos peixes larvais em três níveis de velocidade diferentes: inativo (congelamento) = <5 mm/s, pequeno (cruzeiro) = 5-20 mm/s, e grande (estouro) = >20 mm/s. - Clique em "Parâmetros | Parâmetros de protocolo" do menu suspenso. Na caixa de diálogo, selecione a guia "Tempo". Digite o tempo de observação e o tempo de integração. Após os parâmetros serem inseridos clique em "Ok".
- Para definir os tempos de fotoperíodo claro/escuro e a intensidade da luz para cada fotoperíodo abra a caixa de diálogo de configurações do driver de luz, selecionando "Condução leve" do menu suspenso "Parâmetros".
NOTA: Veja o vídeo do protocolo para definir vários períodos de fotoperóudos claros e escuros. - Depois que os parâmetros de rastreamento de vídeo tiverem sido definidos, salve o protocolo de observação.
NOTA: Este protocolo observa o comportamento do peixe durante um período de 50 minutos que inclui uma fase de aclimatação de 10 minutos seguida por 4 fases claras/escuras alteradas que consistem em dois períodos de luz de 10 minutos e dois períodos escuros de 10 minutos. O tempo de integração é definido para medir o comportamento para cada minuto do ensaio comportamental de 50 minutos.
2. Observação de Locomotor de Peixes Larval e Comportamento Fotomotor
- Coloque a placa do poço contendo peixes experimentais na câmara de gravação comportamental.
- No software de rastreamento de vídeo, abra o protocolo de rastreamento desenvolvido na próxima etapa.
- No visualizador de rastreamento de vídeo, verifique se todas as larvas estão visíveis na tela do computador, que apenas uma larva individual está presente em cada poço, e que os poços individuais estão alinhados dentro das áreas de observação que foram definidas nas etapas 1.1.5 e 1.1.6.
- Clique em "Experiment | Executar".
NOTA: O sistema solicitará ao usuário que forneça um nome e localização para salvar os dados de observação. - Uma vez especificado o nome e a localização dos dados de observação, clique no ícone "Várias imagens ao vivo" para destacar todas as áreas de visualização pré-definidas
NOTA: Este ícone está localizado na parte superior da tela do computador e aparece como uma caixa dividida em quatro quadrados menores. Clicar neste ícone destacará todas as áreas de visualização pré-definidas. - Feche o painel da câmara de gravação e clique em "Fundo | Inicie" no monitor do computador.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
48-well plates | Fisher Scientific | 08-772-52 | Larval zebrafish behavioral recording chambers |
24-well plates | VWR | 10062-896 | Larval fathead minnow behavioral recording chambers |