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Encyclopedia of Experiments

Ensaio de resposta fotomotora: um método para medir a resposta comportamental do zebrafish larval a uma mudança repentina na condição de iluminação

Overview

Este vídeo descreve o ensaio de resposta fotomotor de zebrafish e larvas de peixinho-gordo usando um software de rastreamento automatizado. O protocolo mede a resposta comportamental dos peixes larvais após uma mudança brusca no estado de iluminação.

Protocol

1. Calibração dos parâmetros de rastreamento de vídeo

  1. Antes das medidas comportamentais, defina parâmetros de observação e calibração no software de faixa de vídeo (ver Tabela de Materiais).
    1. Coloque uma placa de poço na câmara de gravação com pelo menos 1 peixe larval em um poço individual. Use a placa e o peixe associado como representações para definir parâmetros de calibração.
    2. No software de faixa de vídeo, clique em "Arquive | Gerar Protocolo", que abrirá uma caixa de diálogo "assistente de criação de protocolo". No campo "Contagem de localização", digite o número de poços individuais da placa do poço e clique em "OK".
    3. Na parte superior da tela, clique em "Exibir | Tela Cheia", que levará o sistema a exibir uma visão de câmera aérea da placa do poço.
    4. Clique no ícone "Desenhar áreas", que aparece como três formas multicoloridas. À direita da área de visualização da placa de poço, selecione o ícone de círculo no campo rotulado de "Áreas".
    5. Use o cursor para delinear a área de rastreamento de vídeo circular no poço superior esquerdo da placa do poço. Selecione "Marca superior direita" e, em seguida, delineie bem a área de visualização do canto superior direito. Em seguida, selecione "Marca inferior" para delinear bem o canto inferior direito.
      NOTA: Após o desenho do contorno circular, é provável que sua posição precise ser ajustada.  Para ajustar a posição do contorno, clique em "selecionar" e, em seguida, use o cursor para mover a área delineada. Além disso, os contornos podem ser replicados clicando em "Copiar" e, em seguida, "Colar".
    6. Depois que as áreas de rastreamento superior esquerdo, superior direito e inferior direito foram definidas, clique em "Build" para solicitar que o software delineie automaticamente as áreas de visualização dos poços restantes.
    7. Na área rotulada "Calibração", clique em "Escala de desenho". Use o cursor para desenhar uma linha horizontal através da placa. Uma vez que a linha é desenhada, uma caixa de diálogo rotulada como "Medição de calibração" aparecerá. Digite o comprimento da placa do poço e clique em "OK".
    8. Saia do gerenciador de desenho clicando no ícone "Desenhar áreas".
    9. Clique no ícone "Ladrilhos".  Usando o cursor, destaque todas as caixas que aparecem na tela de visualização para que cada caixa fique verde.
      NOTA: O ícone de telhas aparece como um grupo de seis quadrados pequenos individuais
    10. "Clique em Exibir| Tela cheia".  À direita da área de visualização da placa, clique em "Bkg" na caixa rotulada "Limiar de Detecção". Use a barra de ajuste de limiar para definir o limiar de detecção de pixels. Uma vez que o limiar de detecção de pixels apropriado seja selecionado, clique em "Aplicar ao grupo".
      NOTA: Este protocolo define o limiar de detecção em 13 no modo preto para observações de zebrafish e em 110 no modo transparente para observações de peixinho-cabeça-de-gordura.
    11. Na caixa rotulada "Limiar de movimento", digite os parâmetros de rastreamento de velocidade de movimento desejados. Uma vez definidos os parâmetros de velocidade, clique em "Aplicar ao grupo".
      NOTA: Este protocolo define movimentos pequenos/grandes em movimentos de 20 mm/s e movimentos inativos/pequenos a 5 mm/s. Essas seleções programam o software para rastrear o movimento dos peixes larvais em três níveis de velocidade diferentes: inativo (congelamento) = <5 mm/s, pequeno (cruzeiro) = 5-20 mm/s, e grande (estouro) = >20 mm/s.
    12. Clique em "Parâmetros | Parâmetros de protocolo" do menu suspenso. Na caixa de diálogo, selecione a guia "Tempo". Digite o tempo de observação e o tempo de integração. Após os parâmetros serem inseridos clique em "Ok".
    13. Para definir os tempos de fotoperíodo claro/escuro e a intensidade da luz para cada fotoperíodo abra a caixa de diálogo de configurações do driver de luz, selecionando "Condução leve" do menu suspenso "Parâmetros".
      NOTA: Veja o vídeo do protocolo para definir vários períodos de fotoperóudos claros e escuros.
    14. Depois que os parâmetros de rastreamento de vídeo tiverem sido definidos, salve o protocolo de observação.
      NOTA: Este protocolo observa o comportamento do peixe durante um período de 50 minutos que inclui uma fase de aclimatação de 10 minutos seguida por 4 fases claras/escuras alteradas que consistem em dois períodos de luz de 10 minutos e dois períodos escuros de 10 minutos. O tempo de integração é definido para medir o comportamento para cada minuto do ensaio comportamental de 50 minutos.

2. Observação de Locomotor de Peixes Larval e Comportamento Fotomotor

  1. Coloque a placa do poço contendo peixes experimentais na câmara de gravação comportamental.
  2. No software de rastreamento de vídeo, abra o protocolo de rastreamento desenvolvido na próxima etapa.
  3. No visualizador de rastreamento de vídeo, verifique se todas as larvas estão visíveis na tela do computador, que apenas uma larva individual está presente em cada poço, e que os poços individuais estão alinhados dentro das áreas de observação que foram definidas nas etapas 1.1.5 e 1.1.6.
  4. Clique em "Experiment | Executar".
    NOTA: O sistema solicitará ao usuário que forneça um nome e localização para salvar os dados de observação.
  5. Uma vez especificado o nome e a localização dos dados de observação, clique no ícone "Várias imagens ao vivo" para destacar todas as áreas de visualização pré-definidas
    NOTA: Este ícone está localizado na parte superior da tela do computador e aparece como uma caixa dividida em quatro quadrados menores. Clicar neste ícone destacará todas as áreas de visualização pré-definidas.
  6. Feche o painel da câmara de gravação e clique em "Fundo | Inicie" no monitor do computador.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well plates Fisher Scientific 08-772-52 Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates VWR 10062-896 Larval fathead minnow behavioral recording chambers

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