Ensayo de respuesta fotomotora: Un método para medir la respuesta conductual del pez cebra larvario a un cambio repentino en la condición de iluminación

Overview

Este video describe el ensayo de respuesta fotomotora del pez cebra y las larvas de cabeza de grasa minnow utilizando un software de seguimiento automatizado. El protocolo mide la respuesta conductual de los peces larvarios después de un cambio repentino en el estado de iluminación.

Protocol

1. Calibración de parámetros de seguimiento de vídeo

1. Antes de las medidas de comportamiento, establezca los parámetros de observación y calibración en el software de pista de vídeo (consulte Tabla de materiales).
   1. Coloque una placa de pozo en la cámara de grabación con al menos 1 pez larvario en un pozo individual. Utilice la placa y los peces asociados como representaciones para establecer parámetros de calibración.
   2. En el software de pista de vídeo, haga clic en "Archivo | Generate Protocol", que abrirá un cuadro de diálogo "asistente de creación de protocolos". En el campo "Recuento de ubicación", introduzca el número de pozos individuales de la placa de pozo y, a continuación, haga clic en "Aceptar".
   3. En la parte superior de la pantalla, haga clic en "Ver | Pantalla completa", lo que pedirá al sistema que muestre una vista de la cámara superior de la placa del pozo.
   4. Haga clic en el icono "Dibujar áreas", que aparece como tres formas multicolores. A la derecha del área de visualización de la placa de pozo, seleccione el icono de círculo en el campo con la etiqueta "Áreas".
   5. Utilice el cursor para delinear el área de seguimiento de vídeo circular en el pozo superior izquierdo de la placa del pozo. Seleccione "Marca superior derecha" y luego describa bien el área de visualización de la parte superior derecha. A continuación, seleccione "Marca inferior" para delinear bien la parte inferior derecha.
      NOTA: Después de dibujar el contorno circular, es probable que deba ajustarse su posición.  Para ajustar la posición del contorno, haga clic en "seleccionar" y, a continuación, utilice el cursor para mover el área descrita. Además, los contornos se pueden replicar haciendo clic en "Copiar" y luego "Pegar".
   6. Después de que se hayan definido las áreas de seguimiento del pozo superior izquierdo, superior derecho e inferior derecho, haga clic en "Compilar" para solicitar al software que delinee automáticamente las áreas de visualización de los pozos restantes.
   7. En el área denominada "Calibración", haga clic en "Dibujar escala". Utilice el cursor para dibujar una línea horizontal a través de la placa. Una vez dibujada la línea, aparecerá un cuadro de diálogo con la etiqueta "Medición de calibración". Introduzca la longitud de la placa del pozo y haga clic en "Aceptar".
   8. Salga del gestor de dibujos haciendo clic en el icono "Dibujar áreas".
   9. Haga clic en el icono "Mosaicos".  Con el cursor, resalte todos los cuadros que aparecen en la pantalla de visualización para que cada cuadro sea verde.
      NOTA: El icono Azulejos aparece como un grupo de seis cuadrados pequeños individuales
   10. "Haga clic en Ver| Pantalla completa".  A la derecha del área de visualización de la placa, haga clic en "Bkg" en el cuadro con la etiqueta "Umbral de detección". Utilice la barra de ajuste de umbral para establecer el umbral de detección de píxeles. Una vez seleccionado el umbral de detección de píxeles adecuado, haga clic en "Aplicar al grupo".
       NOTA: Este protocolo establece el umbral de detección en 13 en modo negro para observaciones de peces cebra y en 110 en modo transparente para observaciones de cabeza de grasa minnow.
   11. En el cuadro con la etiqueta "Umbral de movimiento", introduzca los parámetros de seguimiento de velocidad de movimiento deseados. Una vez establecidos los parámetros de velocidad, haga clic en "Aplicar al grupo".
       NOTA: Este protocolo establece movimientos pequeños/grandes a 20 mm/s y movimientos inactivos/pequeños a 5 mm/s. Estas selecciones programan el software para rastrear el movimiento larvario de los peces a tres niveles de velocidad diferentes: inactivo (congelación) = <5 mm/s, pequeño (crucero) = 5-20 mm/s, y grande (ráfaga) = >20 mm/s.
   12. Haga clic en "Parámetros | Parámetros de protocolo" en el menú desplegable. En el cuadro de diálogo, seleccione la pestaña "Tiempo". Introduzca el tiempo de observación y el tiempo de integración. Después de introducir los parámetros, haga clic en "Aceptar".
   13. Para establecer los tiempos de fotoperiodo claro/oscuro y la intensidad de la luz para cada fotoperiodo, abra el cuadro de diálogo configuración del controlador de luz seleccionando "Conducción ligera" en el menú desplegable "Parámetros".
       NOTA: Consulte el vídeo de protocolo para configurar varios fotoperiods de color claro-oscuro.
   14. Una vez establecidos los parámetros de seguimiento de vídeo, guarde el protocolo de observación.
       NOTA: Este protocolo observa el comportamiento de los peces durante un período de 50 minutos que incluye una fase de aclimatación de 10 minutos seguida de 4 fases de luz/oscuridad que alteran dos períodos de luz de 10 minutos y dos períodos oscuros de 10 minutos. El tiempo de integración se establece para medir el comportamiento de cada minuto de la prueba de comportamiento de 50 minutos.

2. Observación del comportamiento de los peces larvarios locomotores y fotomotores

1. Coloque la placa del pozo que contiene peces experimentales en la cámara de grabación conductual.
2. En el software de seguimiento de vídeo, abra el protocolo de seguimiento desarrollado en el siguiente paso.
3. En el visor de seguimiento de vídeo, compruebe que todas las larvas estén visibles en la pantalla del ordenador, que solo haya una larva individual en cada pozo y que los pozos individuales estén alineados dentro de las áreas de observación definidas en los pasos 1.1.5 y 1.1.6.
4. Haga clic en "Experimento | Ejecutar".
   NOTA: El sistema pedirá al usuario que proporcione un nombre y una ubicación para guardar los datos de observación.
5. Una vez especificado el nombre y guardar la ubicación de los datos de observación, haga clic en el icono "Varias imágenes en vivo" para resaltar todas las áreas de visualización predefinidos
   NOTA: Este icono se encuentra en la parte superior de la pantalla del ordenador y aparece como un cuadro dividido en cuatro cuadrados más pequeños. Al hacer clic en este icono se resaltarán todas las áreas de visualización predefinidos.
6. Cierre el panel de la cámara de grabación y haga clic en "Fondo | Start" en el monitor del ordenador.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers