Fotomotor Yanıt Tahlili: Larva Zebra Balıklarının Aydınlatma DurumundaKi Ani Bir Değişikliğe Davranışsal Tepkisini Ölçmek için Bir Yöntem

Overview

Bu video, otomatik bir izleme yazılımı kullanarak zebra balığı ve fathead minnow larvalarının fotomotor yanıt testini açıklar. Protokol, aydınlatma durumundaki ani bir değişikliğin ardından larva balıklarının davranışsal tepkisini ölçer.

Protocol

1. Video İzleme Parametrelerinin Kalibrasyonu

1. Davranışsal önlemlerden önce, video izleme yazılımında gözlem ve kalibrasyon parametrelerini ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Kayıt odasına tek bir kuyuya en az 1 larva balığı içeren bir kuyu plakası yerleştirin. Kalibrasyon parametrelerini ayarlamak için plakayı ve ilişkili balıkları temsil olarak kullanın.
   2. Video izleme yazılımında, "Dosya | "Protokol oluşturma sihirbazı" iletişim kutusu açacak olan Protokol Oluştur". "Konum Sayısı" alanına, kuyu plakasının kişi kuyularının sayısını girin ve ardından "Tamam" ı tıklayın.
   3. Ekranın üst kısmında "| Görüntüle"yi tıklatın. Tam Ekran", sistemden kuyu plakasının tepegöz kamera görünümünü görüntülemesini ister.
   4. Üç çok renkli şekil olarak görünen "Alanları Çiz" simgesini tıklatın. Kuyu plakası görüntüleme alanının sağında, "Alanlar" etiketli alanda daire simgesini seçin.
   5. Kuyu plakasının sol üst kısmındaki dairesel video izleme alanını tanımlamak için imleci kullanın. "Sağ Üst İşareti"ni seçin ve sağ üstteki görüntüleme alanını iyi bir şekilde özetleyin. Ardından, sağ alt kısmı iyi özetlemek için "Alt İşaretle"yi seçin.
      NOT: Dairesel anahat çizildikten sonra, konumunun ayarlanması gerekecektir.  Anahattın konumunu ayarlamak için "seç"i tıklatın ve sonra anahattılan alanı taşımak için imleci kullanın. Ayrıca, anahatlar "Kopyala" ve sonra "Yapıştır" tıklatılarak çoğaltılabilir.
   6. Sol üst, sağ üst ve sağ alt kuyu izleme alanları tanımlandıktan sonra, yazılımın kalan kuyuların görüntüleme alanlarını otomatik olarak tanımlamasını istemek için "Oluştur" u tıklayın.
   7. "Kalibrasyon" etiketli alanda "Ölçeği Çiz"i tıklayın. Plaka boyunca yatay bir çizgi çizmek için imleci kullanın. Çizgi çizildikten sonra "Kalibrasyon ölçümü" etiketli bir diyalog kutusu görünecektir. Kuyu plakası uzunluğunu girin ve "Tamam" ı tıklayın.
   8. "Alanları Çiz" simgesini tıklatarak çizim yöneticisinin içinden çıkın.
   9. "Kutucuklar" simgesine tıklayın.  İmleci kullanarak, her kutunun yeşil olması için görüntüleme ekranında görünen tüm kutuları vurgulayın.
      NOT: Kutucuklar simgesi altı ayrı küçük kareden oluşan bir grup olarak görünür
   10. "Görüntüle| Tam Ekran".  Plaka görüntüleme alanının sağında, "Algılama Eşiği" etiketli kutuda "Bkg" ı tıklayın. Piksel algılama eşiğini ayarlamak için eşik ayarlama çubuğunu kullanın. Uygun piksel algılama eşiği seçildikten sonra "Gruba Uygula"yı tıklatın.
       NOT: Bu protokol, zebra balığı gözlemleri için algılama eşiğini siyah modda 13' e ve fathead minnow gözlemleri için şeffaf modda 110 olarak ayarlar.
   11. "Hareket Eşiği" etiketli kutuya istediğiniz hareket hızı izleme parametrelerini girin. Hız parametreleri ayarlandıktan sonra "Gruba Uygula" yı tıklayın.
       NOT: Bu protokol küçük/büyük hareketleri 20 mm/s'ye, aktif olmayan/küçük hareketleri ise 5 mm/s'ye ayarlar. Bu seçimler, yazılımı larva balık hareketini üç farklı hız seviyesinde izlemek için programlar: etkin olmayan (donma) = <5 mm/sn, küçük (seyir) = 5–20 mm/s ve büyük (patlama) = >20 mm/s.
   12. "Parametreler | Protokol Parametreleri" açılır menüsünden. İletişim kutusunda "Zaman" sekmesini seçin. Gözlem süresini ve tümleştirme süresini girin. Parametreler girildikten sonra "Tamam" ı tıklayın.
   13. Her fotoperiyod için açık / koyu fotoperiyod sürelerini ve ışık yoğunluğunu ayarlamak için "Parametreler" açılır menüsünden "Hafif Sürüş" seçeneğini seçerek ışık sürücüsü ayarları diyalog kutusunu açın.
       NOT: Birden fazla açık koyu fotoperiyod ayarlamak için protokol videosuna bakın.
   14. Video izleme parametreleri ayarlandıktan sonra gözlem protokolünü kaydedin.
       NOT: Bu protokol, 10 dakikalık bir alışma evresi ve ardından iki 10 dakikalık ışık periyodu ve iki 10 dakikalık karanlık dönemden oluşan 4 değişen açık/karanlık faz içeren 50 dakikalık bir süre boyunca balık davranışını gözlemler. Tümleştirme süresi, 50 dakikalık davranışsal denemenin her dakikası için davranışı ölçmek üzere ayarlanır.

2. Larva Balık Locomotor ve Fotomotor Davranışının Gözlemlenmesi

1. Deneysel balık içeren kuyu plakasını davranışsal kayıt odasına yerleştirin.
2. Video izleme yazılımında, bir sonraki adımda geliştirilen izleme protokolünü açın.
3. Video izleme görüntüleyicisinde, tüm larvaların bilgisayar ekranında görünür olduğundan, her kuyuda yalnızca bir ayrı larva bulunduğundan ve bireysel kuyuların 1.1.5 ve 1.1.6 adımlarında tanımlanan gözlem alanlarında hizalandığına emin olun.
4. "Deney | Yürütün".
   NOT: Sistem, kullanıcıdan gözlem verilerini kaydetmek için bir ad ve konum sağlamasını ister.
5. Gözlem verilerinin adı ve kaydetme konumu belirtildikten sonra, önceden tanımlanmış tüm görüntüleme alanlarını vurgulamak için "Birkaç Canlı Görüntü" simgesine tıklayın
   NOT: Bu simge bilgisayar ekranının üst kısmında bulunur ve dört küçük kareye bölünmüş bir kutu olarak görünür. Bu simgeye tıklanın, önceden tanımlanmış tüm görüntüleme alanlarını vurgular.
6. Kayıt odasının panelini kapatın ve "Arka plan | Başlat", bilgisayar monitöründe.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers