Test di risposta fotomotoria: un metodo per misurare la risposta comportamentale di Larval Zebrafish a un improvviso cambiamento nelle condizioni di illuminazione

Overview

Questo video descrive il saggio di risposta fotomotoria delle larve di zebrafish e fathead minnow utilizzando un software di tracciamento automatico. Il protocollo misura la risposta comportamentale del pesce larvale a seguito di un improvviso cambiamento delle condizioni di illuminazione.

Protocol

1. Calibrazione dei parametri di tracciamento video

1. Prima delle misure comportamentali, impostare i parametri di osservazione e calibrazione nel software di traccia video (vedere Table of Materials).
   1. Posizionare una piastra del pozzo nella camera di registrazione con almeno 1 pesce larvale in un pozzo individuale. Utilizzare la piastra e il pesce associato come rappresentazioni per impostare i parametri di calibrazione.
   2. Nel software di traccia video fare clic su "File | Generate Protocol", che aprirà una finestra di dialogo "Creazione guidata protocollo". Nel campo "Conteggio posizione", immettere il numero di pozzi individui della piastra del pozzo, quindi fare clic su "OK".
   3. Nella parte superiore dello schermo fare clic su "Visualizza | Schermo intero", che richiederà al sistema di visualizzare una vista della telecamera aerea della piastra del pozzo.
   4. Fare clic sull'icona "Disegna aree", visualizzata come tre forme multicolori. A destra dell'area di visualizzazione della piastra del pozzo, selezionare l'icona del cerchio nel campo etichettato "Aree".
   5. Utilizzare il cursore per delineare l'area di tracciamento video circolare nel pozzo in alto a sinistra della piastra del pozzo. Selezionare "Contrassegno in alto a destra", quindi delineare bene l'area di visualizzazione in alto a destra. Quindi, selezionare "Segno inferiore" per delineare bene in basso a destra.
      NOTA: Dopo aver disegnare il contorno circolare, è probabile che la sua posizione sia necessaria per essere regolata.  Per regolare la posizione del contorno, fare clic su "seleziona" e quindi usare il cursore per spostare l'area delineata. Inoltre, i contorni possono essere replicati facendo clic su "Copia" e quindi su" Incolla".
   6. Dopo aver definito le aree di tracciamento del pozzo in alto a sinistra, in alto a destra e in basso a destra, fare clic su "Costruisci" per richiedere al software di delineare automaticamente le aree di visualizzazione dei pozzi rimanenti.
   7. Nell'area con l'etichetta "Calibrazione", fare clic su "Disegna scala". Utilizzare il cursore per disegnare una linea orizzontale sulla piastra. Una volta tracciata la linea, apparirà una finestra di dialogo con l'etichetta "Misurazione calibrazione". Immettere la lunghezza della piastra del pozzo e fare clic su "OK".
   8. Uscire dal gestore del disegno facendo clic sull'icona "Disegna aree".
   9. Fare clic sull'icona "Riquadri".  Usando il cursore, evidenzia tutte le caselle visualizzate nella schermata di visualizzazione in modo che ogni casella sia verde.
      NOTA: L'icona Riquadri viene visualizzata come un gruppo di sei singoli quadratini
   10. "Visualizza clic| Schermo intero".  A destra dell'area di visualizzazione della piastra, fare clic su "Bkg" nella casella "Soglia di rilevamento". Utilizzare la barra di regolazione della soglia per impostare la soglia di rilevamento dei pixel. Una volta selezionata la soglia di rilevamento dei pixel appropriata, fare clic su "Applica al gruppo".
       NOTA: Questo protocollo fissa la soglia di rilevamento a 13 in modalità nera per le osservazioni zebrafish e a 110 in modalità trasparente per le osservazioni del minnow fathead.
   11. Nella casella "Soglia movimento", immettere i parametri di tracciamento della velocità di movimento desiderati. Una volta impostati i parametri di velocità, fare clic su "Applica al gruppo".
       NOTA: Questo protocollo imposta movimenti di piccole/grandi dimensioni a 20 mm/s e movimenti inattivi/piccoli a 5 mm/s. Queste selezioni programmano il software per tenere traccia del movimento dei pesci larvali a tre diversi livelli di velocità: inattivo (congelamento) = <5 mm/s, piccolo (crociera) = 5-20 mm/s e grande (scoppio) = >20 mm/s.
   12. Fare clic su "Parametri | Parametri protocollo" dal menu a discesa. Nella finestra di dialogo selezionare la scheda "Ora". Immettere il tempo di osservazione e il tempo di integrazione. Dopo aver immesso i parametri, fare clic su "OK".
   13. Per impostare i tempi del fotoperiodo chiaro/scuro e l'intensità della luce per ogni fotoperiodo, aprire la finestra di dialogo impostazioni driver luce selezionando "Guida leggera" dal menu a discesa "Parametri".
       NOTA: Vedere il video del protocollo per l'impostazione di più fotoperiodi chiaro-scuro.
   14. Dopo aver impostato i parametri di tracciamento video, salvare il protocollo di osservazione.
       NOTA: Questo protocollo osserva il comportamento dei pesci in un periodo di 50 minuti che include una fase di acclimatazione di 10 minuti seguita da 4 fasi di alterazione della luce / buio costituite da due periodi di luce di 10 minuti e due periodi di buio di 10 minuti. Il tempo di integrazione è impostato per misurare il comportamento per ogni minuto della prova comportamentale di 50 minuti.

2. Osservazione del locomotore del pesce larvale e del comportamento fotomotore

1. Posizionare la piastra del pozzo contenente pesci sperimentali nella camera di registrazione comportamentale.
2. Nel software di tracciamento video, aprire il protocollo di tracciamento sviluppato nel passaggio successivo.
3. Nel visualizzatore di tracciamento video, verificare che tutte le larve siano visibili sullo schermo del computer, che in ogni pozzo sia presente una sola larva e che i singoli pozzi siano allineati all'interno delle aree di osservazione definite nei passaggi 1.1.5 e 1.1.6.
4. Clicca su "Esperimento | Eseguire".
   NOTA: Il sistema richiederà all'utente di fornire un nome e una posizione per salvare i dati di osservazione.
5. Una volta specificato il nome e la posizione di salvataggio dei dati di osservazione, fare clic sull'icona "Diverse immagini live" per evidenziare tutte le aree di visualizzazione predefiniti
   NOTA: Questa icona si trova nella parte superiore dello schermo del computer e viene visualizzata come una scatola divisa in quattro quadrati più piccoli. Cliccando su questa icona verranno evidenziate tutte le aree di visualizzazione predefiniti.
6. Chiudete il pannello della camera di registrazione e fate clic su "Sfondo | Start" sul monitor del computer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers