Overview
يصف هذا الفيديو مقايسة التقاط الفريسة. يناقش الفيديو طريقة دراسة سلوك التقاط الفريسة ليرقات حمار وحشي بعد استئصال الليزر لخلايا عصبية محددة.
Protocol
1. تقييم العواقب السلوكية بعد الاستئصال بالليزر
- إعداد نظام تسجيل سلوكي يتكون من مجسم مجهز بكاميرا فيديو. استخدام كاميرا مع برنامج الحصول على صورة مناسبة، التجارية أو حسب الطلب (الشكل 1A).
- تحسين حالة الإضاءة بحيث يمكن الكشف عن الباراميسيوم عن طريق معالجة الصور. على سبيل المثال، استخدم ضوء LED أبيض حلقي مع فاصل(الشكل 1B).
ملاحظة: المسافة من، وزاوية، LED يؤثر على مظهر العينة(أي،مشرق في الخلفية المظلمة أو الظلام في الخلفية الساطعة) ، وبالتالي، حاسمة لمعالجة الصور الناجحة. تحديد أفضل ارتفاع للمسافة(الشكل 1C). - ضع يرقة حمار وحشي (تم استردادها من تجربة استئصال الليزر الموصوفة في القسم 1) في غرفة تسجيل سلوكية (تم إرفاقها بشريحة زجاجية) مع إزالة الختم العلوي الأصلي(الشكل 1D).
- جمع 50 paramecia علقت في الماء من الكأس باستخدام micropipette ووضعها في غرفة التسجيل.
- ضع زلة غطاء أعلى غرفة التسجيل. وضع قطرة صغيرة من الماء على غطاء زلة قبل وضعها على سطح الماء من غرفة التسجيل لتجنب إدخال الهواء في الغرفة.
ملاحظة: في هذه الخطوة، بعض المياه مع الباراميشيا سوف تفيض من غرفة التسجيل. أما العدد المتبقي من الباراميشيا في غرفة التسجيل فسيكون حوالي 30-40. - ضع غرفة التسجيل (التي تحتوي على يرقة وباراميسيا)في نظام الإضاءة(الشكل 1D).
- ابدأ التسجيل الفاصل الزمني بمعدل 10 إطارا في الثانية لمدة 11 دقيقة (6600 إطار).
- (اختياري) لكل يرقة تم اختبارها للسلوك ، لاحظ مضان المناطق المبلد بالليزر عن طريق المجهر الفلوري لتأكيد فعالية استئصال الليزر(أيالغياب ، أو انخفاض عدد الخلايا الفلورية بشكل كبير في المنطقة المشععة بالليزر).
ملاحظة: وحتى بعد التشعيع، لا يزال من الممكن ملاحظة بعض الخلايا الفلورية بسبب ظهور التعبير الجيني Gal4 في وقت لاحق في الخلايا التي تمايزت بعد الاستئصال. - بعد تسجيل سلوك اليرقة ، للتعويض عن عدم وجود اتساق في الخلفية ، قم بإجراء تقسيم بكسل بكسل لكل إطار بواسطة صورة متوسطة في فيجي: انقر فوق "عملية" و "حاسبة الصورة" و "العملية: تقسيم" و "32 بت (تعويم)" و "OK". لإنشاء صورة متوسطة، انقر فوق "صورة" و"مداخن" و"Z-Project" و"متوسط الكثافة" و"موافق"(الشكل 1E وF).
- عد عدد الباراميسيا اليسار في الغرفة من خلال النقر على 'تحليل'، 'تحليل الجسيمات'، ووضع نطاق المنطقة التي تغطي جميع الباراميسيا،والتحقق من 'إظهار:أقنعة' مربع الاختيار، والنقر على 'موافق'. سيوفر خيار "إظهار:أقنعة" صورة بارامسيا مستخرجة(الشكل 1G)، مع قائمة بعدد الجسيمات(paramecia)في كل إطار.
- رسم عدد الباراميسيا اليسار في غرفة التسجيل مع مرور الوقت. نظرا لأن تقديرات عدد الباراميسيا صاخبة ، فإننا نوصي بإجراء متوسط متحرك على كل نقطة في نطاق من 600 إطار (دقيقة واحدة) على جدول البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام التي يمكن أن فريسة التقاط المقايسة والبيانات التمثيلية في يرقات حمار وحشي الليزر الاجتثاث. (أ)نظام التسجيل السلوكي. تم تجهيز المنظار المجسم بكاميرا CMOS. تم الحصول على الصور باستخدام برنامج نصي حسب الطلب. (ب) مكونات نظام الإضاءة. ورقة رمادية اللون، ناشر زجاجي، ضوء حلقة LED بيضاء، الناشر، فاصل حسب الطلب (من الورق المقوى)، والناشر مع ثقب في المركز. (ج)نظام الإضاءة تجميعها من الأجزاء المبينة في B. (D) غرفة تسجيل لالتقاط فريسة المقايسة. تم وضع حجرة (قطرها: 20 مم؛ العمق: 2.5 مم) على شريحة زجاجية. الختم العلوي الأصلي للغرفة كان مقشرا تم وضع غطاء زجاجي على غرفة التسجيل. (ه) صورة الخام من إطار الفيلم المسجل. (F)إطار مقسم (بكسل بكسل) على صورة متوسطة في فيلم. لاحظ أنه يمكن تعويض الخلفية غير الموحدة في الإضاءة من خلال معالجة الصور هذه. (G) الباراميسيا المستخرجة من إطار باستخدام وظيفة "تحليل الجسيمات" في فيجي. (H)مثال الصورة في فيجي مع عتبة تطبيقها. الباراميسيا تبدو مشرقة ، في حين أن عيون يرقة الحمار الوحشي تبدو داكنة ، والخلفية رمادية. يمكن حساب التغيرات في أوضاع العين(أيالزوايا فيما يتعلق بمحور الجسم) ، إذا لزم الأمر. (I) بيانات تجريبية تمثيلية لاستهلاك الباراميسيوم في يرقة تحكم ذات لمبة شمية (OB) ويرقات ما قبل استئصال اليرقات (PT). استئصال Pretectum خفضت بشكل كبير فريسة الصيد القدرة في حين لم يؤثر الاستئصال لمبة الشم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Model:C11440-22CU | A scientific CMOS camera |
| SZX7 | Olympus | Stereoscope | |
| A ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
