猎物捕获分析：研究斑马鱼幼虫捕获行为的方法

Overview

此视频描述了猎物捕获检测。该视频讨论了研究特定神经元激光消融后斑马鱼幼虫捕获行为的方法。

Protocol

1. 激光消融后的行为后果评估

1. 设置一个行为记录系统，该系统由配备摄像机的立体镜组成。使用带有适当图像采集软件的相机，即商用或定制（图1A）。
2. 优化照明条件，以便通过图像处理检测到参数。例如，使用带垫片的环形白色 LED 灯（图 1B）。
   注：LED 的距离和角度会影响样品的外观（即在深色背景中明亮或在明亮背景中较暗），因此，对于图像处理的成功至关重要。确定垫片的最佳高度（图1C）。
3. 将斑马鱼幼虫（从第 1 节中描述的激光消融实验中恢复）放置在行为记录室（附着在玻璃幻灯片上），并删除原始顶部密封件（图 1D）。
4. 使用微皮带从烧嘴中收集50个悬浮在水中的参数，并将其放置在录音室中。
5. 在录音室顶部放置盖单。在放置在录音室的水面上之前，在盖滑上放一小滴水，以避免在录音室中引入空气。
   注：在这一步中，一些带有参数的水会从录音室溢出。录音室中剩余的参数数量约为30-40个。
6. 将录音室（包含幼虫和寄生虫）置于照明系统（图1D）中。
7. 以 10 fps 开始延时录制 11 分钟（6，600 帧）。
8. （可选）对于每一个被测试行为的幼虫，通过荧光显微镜观察激光消融区域的荧光，以确认激光消融的有效性（即在激光照射区域中缺少荧光细胞或显著减少荧光细胞的数量）。
   注：即使在辐照之后，由于Gal4基因表达在消融后分化的细胞中出现晚期，仍然可以观察到一些荧光细胞。
9. 记录幼虫的行为后，为了弥补背景中缺乏均匀性，请按斐济的平均图像逐像素划分每个帧：单击"过程"，"图像计算器"，"操作：分"，"32 位（浮动）结果"和"确定"。要制作平均图像，请单击"图像"、"堆栈"、"Z 项目"、"平均强度"和"确定"（图 1E，F）。
10. 通过单击"分析"、"分析粒子"、设置覆盖所有参数的区域范围、检查"显示：Masks"复选框并单击"确定"来计算在腔室中留下的参数的数量。"显示：面具"选项将提供提取的参数图像（图1G），每个帧中颗粒数（参数）的列表。
11. 绘制随着时间而留在录音室中的参数的数量。由于参数的估计数是嘈杂的，我们建议在电子表格上的 600 帧（1 分钟）范围内对每个点执行移动平均值。

Representative Results

图1。猎物在激光消融的斑马鱼幼虫中捕获检测和代表性数据。（A） 行为记录系统。立体声显微镜配备了CMOS摄像机。图像是使用定制脚本获得的。（B） 照明系统的组件。灰色纸张、玻璃扩散器、白色 LED 环灯、扩散器、定制隔板（纸板）和中间有孔的扩散器。（C） 照明系统从 B . （D） 录音室中显示的部分组装而成，用于猎物捕获检测。在玻璃滑梯上放置了一个腔室（直径：20毫米;深度：2.5毫米）。房间的原封条被剥落了。录音室里放了一个玻璃盖。（E） 从录制电影的帧原始图像。（F） 帧按电影中的平均图像除以（像素除以）。请注意，照明中的非均匀背景可以通过此图像处理进行补偿。（G） 在斐济使用"粒子分析"功能从框架中提取的帕拉梅西亚。（H） 斐济具有应用阈值的图像示例。帕拉米西亚看起来明亮，而斑马鱼幼虫的眼睛看起来黑暗，背景是灰色的。如有必要，可以计算眼部位置的变化（即与身体轴的角度）。（I） 嗅球消融控制幼虫 （OB） 和节前消融幼虫 （PT） 中寄生虫消耗的代表性实验数据。节前消融显著降低了猎物的捕猎能力，而嗅球消融并不影响猎物。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	Model:C11440-22CU	A scientific CMOS camera
SZX7	Olympus		Stereoscope
A ring LED light	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging