Prey Capture Assay: En metode til at studere Prey Capture Behavior af zebrafisk Larva

Overview

Denne video beskriver bytte fange assay. Videoen diskuterer metoden til at studere byttefangstadfærd hos zebrafisklarver efter laserabsationen af specifikke neuroner.

Protocol

1. Vurdering af adfærdsmæssige konsekvenser Efter Laser Ablation

1. Opret et adfærdsoptagelsessystem, der består af et stereoskop udstyret med et videokamera. Brug et kamera med en passende billedopsamlingssoftware, kommerciel eller specialfremstillet (Figur 1A).
2. Optimer belysningstilstanden, så parameciumet kan detekteres ved billedbehandling. Brug f.eks. et ringhvid LED-lys med en afstandsstykke (Figur 1B).
   Bemærk: Afstanden fra og vinklen på LED'en påvirker prøvens udseende(dvs.lys i mørk baggrund eller mørk i lys baggrund) og er derfor afgørende for vellykket billedbehandling. Bestem den bedste højde på afstandsstykket (Figur 1C).
3. Placer en zebrafisk larve (genvundet fra laser-ablation eksperiment beskrevet i afsnit 1) i en adfærdsmæssig optagelse kammer (som var knyttet til et glas dias) med den oprindelige top forsegling fjernet (Figur 1D).
4. Saml 50 paramecia suspenderet i vand fra bægeret ved hjælp af en mikropipette og læg dem i optagekammeret.
5. Placer et dæksedlen oven på optagelseskammeret. Sæt en lille dråbe vand på dækslet, før du placerer på vandoverfladen i optagekammeret for at undgå at indføre luft i kammeret.
   Bemærk: I dette trin vil noget vand med paramecia løbe over fra optagelseskammeret. Det resterende antal paramecia i optagelseskammeret vil være ca. 30-40.
6. Læg optagekammeret (indeholdende larve og paramecia)i belysningssystemet (Figur 1D).
7. Start time-lapse-optagelsen ved 10 fps i 11 min (6.600 billeder).
8. (Valgfrit) For hver larve, der blev testet for adfærd, observere fluorescens af laser-ablated områder ved fluorescerende mikroskopi for at bekræfte effektiviteten af laser-ablation (dvs.fravær, eller væsentligt reduceret antal, fluorescerende celler i laser-bestrålet område).
   Bemærk: Selv efter bestråling kan nogle fluorescerende celler stadig observeres på grund af senere debut af Gal4-genekspression i celler, der differentieres efter ablation.
9. Når larvens opførsel er registreret, skal du for at kompensere for den manglende ensartethed i baggrunden udføre en pixel for pixel-opdeling af hver ramme med et gennemsnitligt billede i Fiji: Klik på 'Proces', 'Billedberegner', 'Operation: Divide', '32-bit(float)resultat' og 'OK'. Hvis du vil oprette et gennemsnitligt billede, skal du klikke på 'Billede', 'Stakke', 'Z-Projekt', 'Gennemsnitlig intensitet' og 'OK' (Figur 1E, F).
10. Tæl antallet af paramecier, der er tilbage i kammeret, ved at klikke på 'Analyser', 'Analyser partikler', angive et områdeområde, der dækker hele parameciaen,markere afkrydsningsfeltet 'Vis:masker' og klikke på 'OK'. Indstillingen 'Vis:Masker' giver et ekstraheret paramecibillede (Figur 1G) med en liste over antallet af partikler (paramecia) i hver ramme.
11. Plot antallet af paramecia tilbage i optagelsen kammer over tid. Da estimaterne for antallet af paramecier er støjende, anbefaler vi, at du udfører et glidende gennemsnit på hvert punkt i et område på 600 billeder (1 min) på regnearket.

Representative Results

Figur 1. Prey fange assay og repræsentative data i laser-ablated zebrafisk larver. (A) Adfærdsregistreringssystem. Stereomikroskopet var udstyret med et CMOS-kamera. Billeder blev anskaffet ved hjælp af et specialfremstillet script. (B) Belysningssystemets komponenter. Et gråfarvet papir, en glasdiffusor, hvidt LED-ringlys, diffusor, en specialfremstillet afstandsstykke (pap) og diffusor med et hul i midten. (C) Belysningssystemet, der er samlet af de dele, der er vist i B. (D) Optagelseskammeret til rovfangstanalysen. Et kammer (diameter: 20 mm; dybde: 2,5 mm) blev placeret på en glasrutsjebane. Kammerets oprindelige øverste segl blev skrællet af. Der blev lagt et glasdæksel på optagelseskammeret. (E) Rå billede fra en ramme af den indspillede film. (F) En ramme divideret (pixel for pixel) med et gennemsnitligt billede i en film. Bemærk, at den ikke-ensartede baggrund i belysning kan kompenseres af denne billedbehandling. (G) Paramecia udvundet af en ramme ved hjælp af funktionen "Partikelanalyse" i Fiji. (H) Eksempel på billede i Fiji med en anvendt tærskel. Paramecia fremstår lyse, mens zebrafisk larvens øjne ser mørke ud, og baggrunden er grå. Ændringer i øjenpositioner (dvs.vinkler med hensyn til kropsaksen) kan beregnes, hvis det er nødvendigt. (I) Repræsentative forsøgsdata om parameciumforbrug i en olfaktorisk-pære-ablated control larve (OB) og en prætectum-ablated larve (PT). Pretectum ablation reducerede byttejagtevnen betydeligt, mens olfaktorisk pæreablation ikke påvirkede den.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	Model:C11440-22CU	A scientific CMOS camera
SZX7	Olympus		Stereoscope
A ring LED light	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging