Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Beutefang-Assay: Eine Methode, um das Beutefangverhalten von Zebrafischlarven zu untersuchen

Overview

Dieses Video beschreibt den Beuteerfassungstest. Das Video behandelt die Methode zur Untersuchung des Beuteerfassungsverhaltens von Zebrafischlarven nach der Laserablation bestimmter Neuronen.

Protocol

1. Beurteilung der Verhaltensfolgen nach Laserablation

  1. Richten Sie ein Verhaltensaufzeichnungssystem ein, das aus einem Stereoskop besteht, das mit einer Videokamera ausgestattet ist. Verwenden Sie eine Kamera mit einer geeigneten Bildaufnahmesoftware, kommerziell oder maßgeschneidert (Abbildung 1A).
  2. Optimieren Sie den Beleuchtungszustand, damit das Paramecium durch Bildverarbeitung erkannt werden kann. Verwenden Sie beispielsweise ein ringweißes LED-Licht mit einem Abstandsraum (Abbildung 1B).
    Hinweis: Der Abstand und der Winkel der LED beeinflusst das Erscheinungsbild der Probe(d. h.hell im dunklen Hintergrund oder dunkel im hellen Hintergrund) und sind daher entscheidend für eine erfolgreiche Bildverarbeitung. Bestimmen Sie die beste Höhe des Abstandsabstands (Abbildung 1C).
  3. Legen Sie eine Zebrafischlarve (aus dem in Abschnitt 1 beschriebenen Laserablationsexperiment wiederhergestellt) in eine Verhaltensaufnahmekammer (die an einem Glasschlitten befestigt war) mit entfernter Original-Obererobbe(Abbildung 1D).
  4. Sammeln Sie 50 Paramecia in Wasser aus dem Becher mit einer Mikropipette und legen Sie sie in der Aufnahmekammer.
  5. Legen Sie einen Deckelzettel auf die Aufnahmekammer. Legen Sie einen kleinen Tropfen Wasser auf den Deckelschlupf, bevor Sie auf die Wasseroberfläche der Aufnahmekammer, um das Einbringen von Luft in die Kammer zu vermeiden.
    Hinweis: In diesem Schritt wird etwas Wasser mit Paramecia aus der Aufnahmekammer überlaufen. Die verbleibende Paramecia-Zahl in der Aufnahmekammer beträgt ca. 30-40.
  6. Legen Sie die Aufnahmekammer (mit einer Larve und Paramezien)in das Beleuchtungssystem (Abbildung 1D).
  7. Starten Sie die Zeitrafferaufnahme mit 10 fps für 11 min (6.600 Frames).
  8. (Optional) Beobachten Sie für jede Larve, die auf Ihr Verhalten getestet wurde, die Fluoreszenz der laserabierten Bereiche durch fluoreszierende Mikroskopie, um die Wirksamkeit der Laserablation zu bestätigen(d. h.Abwesenheit oder signifikant reduzierte Anzahl von Fluoreszenzzellen im laserbestrahlten Bereich).
    Hinweis: Auch nach der Bestrahlung können einige fluoreszierende Zellen aufgrund des späteren Beginns der Gal4-Genexpression in Zellen beobachtet werden, die sich nach der Ablation differenzierten.
  9. Nachdem Sie das Verhalten der Larve aufgezeichnet haben, um den Mangel an Einheitlichkeit im Hintergrund zu kompensieren, führen Sie eine Pixel-für-Pixel-Teilung jedes Frames durch ein durchschnittliches Bild in Fidschi durch: Klicken Sie auf 'Prozess', 'Bildrechner', 'Operation: Divide', '32-bit(float)result' und 'OK'. Um ein durchschnittliches Bild zu erstellen, klicken Sie auf 'Bild', 'Stacks', 'Z-Projekt', 'Durchschnittliche Intensität' und 'OK' (Abbildung 1E, F).
  10. Zählen Sie die Anzahl der Paramecia, die in der Kammer verbleiben, indem Sie auf 'Analysieren', 'Partikel analysieren', einen Bereichsbereich festlegen, der alle Parameciaabdeckt, das Kontrollkästchen 'Anzeigen:Masken' und 'OK' klicken. Die Option 'Show:Masks' stellt ein extrahiertes Parameciabild bereit (Abbildung 1G), mit einer Liste der Anzahl der Partikel (Paramecia) in jedem Frame.
  11. Zeichnen Sie die Anzahl der Paramecia, die im Laufe der Zeit in der Aufnahmekammer verbleiben. Da die Schätzungen der Anzahl der Paramecia laut sind, empfehlen wir, einen gleitenden Durchschnitt an jedem Punkt in einem Bereich von 600 Frames (1 min) auf der Kalkulationstabelle auszuführen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
Abbildung 1. Beuteerfassungstest und repräsentative Daten in laserabilierten Zebrafischlarven. (A) Verhaltensaufzeichnungssystem. Das Stereomikroskop war mit einer CMOS-Kamera ausgestattet. Bilder wurden mit einem benutzerdefinierten Skript erstellt. (B) Komponenten des Beleuchtungssystems. Ein graues Papier, ein Glasdiffusor, weißes LED-Ringlicht, Diffusor, ein maßgeschneiderter Abstandsraum (Karton) und Diffusor mit einem Loch in der Mitte. (C) Das Beleuchtungssystem aus den in B. (D) Aufnahmekammer für den Beuteerfassungstest gezeigten Teilen montiert. Eine Kammer (Durchmesser: 20 mm; Tiefe: 2,5 mm) wurde auf einem Glasschlitten platziert. Die ursprüngliche obere Dichtung der Kammer wurde abgezogen. Eine Glasabdeckung wurde auf die Aufnahmekammer gelegt. (E) Rohbild aus einem Rahmen des aufgenommenen Films. (F) Ein Frame, der durch ein durchschnittliches Bild in einem Film geteilt wird (Pixel für Pixel). Beachten Sie, dass der ungleichmäßige Hintergrund in der Beleuchtung durch diese Bildverarbeitung kompensiert werden kann. (G) Paramecia aus einem Rahmen mit der Funktion "Partikelanalyse" in Fidschi extrahiert. (H) Beispiel für ein Bild in Fidschi mit einem angewendeten Schwellenwert. Paramecia erscheinen hell, während die Augen der Zebrafischlarven dunkel erscheinen und der Hintergrund grau ist. Bei Bedarf können Veränderungen der Augenpositionen(d.h.Winkel in Bezug auf die Körperachse) berechnet werden. (I) Repräsentative experimentelle Daten über den Parameciumverbrauch in einer olfaktorisch-bolzenierten Kontrolllarve (OB) und einer prätectum-ablated Larve (PT). Pretectum Ablation deutlich reduziert Beute Jagd Fähigkeit, während olfaktorische Glühbirne Ablation nicht beeinflussen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Imageing Chambers Grace Bio-Labs CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5 Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0  Hamamatsu Photonics Model:C11440-22CU  A scientific CMOS camera
SZX7 Olympus Stereoscope
A ring LED light CCS   Model: LDR2-100SW2-LA White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth Molecular Probes Catalogue # S-24732 Used as a recording chamber in Ca imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Leerer Wert Ausgabe
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter