Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

טרף ללכוד Assay: שיטה ללמוד את התנהגות לכידת הטרף של זברה

Overview

וידאו זה מתאר את טרף לכידת assay. הסרטון דן בשיטה לחקור התנהגות לכידת טרף של זחלי זברה לאחר אבלציה לייזר של נוירונים ספציפיים.

Protocol

1. הערכת ההשלכות ההתנהגותיות בעקבות אבלציה בלייזר

  1. הגדר מערכת הקלטה התנהגותית המורכבת מסטריאוסקופ המצויד במצלמת וידאו. השתמש במצלמה עם תוכנה מתאימה לרכישת תמונות, מסחרית או מותאמת אישית (איור 1A).
  2. מטב את מצב התאורה כך שניתן יהיה לזהות את הפרמציום באמצעות עיבוד תמונה. לדוגמה, השתמש באור LED לבן טבעת עם מרווח (איור 1B).
    שים לב: המרחק מה- LED והזווית שלו משפיעים על מראה המדגם (כלומר,בהיר ברקע כהה או כהה ברקע בהיר) ולכן הם קריטיים לעיבוד תמונה מוצלח. קבעו את הגובה הטוב ביותר של המרווח (איור 1C).
  3. הניחו זחל זברה (התאושש מניסוי אבלציה בלייזר המתואר בסעיף 1) בתא הקלטה התנהגותי (שהיה מחובר למגלשת זכוכית) עם החותם העליון המקורי הוסר (איור 1D).
  4. לאסוף 50 paramecia תלוי במים מן הכף באמצעות micropipette ולמקם אותם בתא ההקלטה.
  5. הנח תלוש כיסוי על תא ההקלטה. שים טיפה קטנה של מים על תלוש הכיסוי לפני הנחת על פני המים של תא ההקלטה, כדי למנוע החדרת אוויר בתא.
    שים לב: בשלב זה, מים עם פרמציה יעלו על גדותיהם מתא ההקלטה. המספר הנותר של פרמציה בתא ההקלטה יהיה בערך 30-40.
  6. הנח את תא ההקלטה (המכיל זחל ופרמציה)במערכת התאורה (איור 1D).
  7. התחל את הקלטת זמן לשגות ב 10 fps במשך 11 דקות (6,600 מסגרות).
  8. (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' עבור כל זחל שנבדק להתנהגות, שים לב לפלואורסצנטיות של האזורים הפלואורסצנטיים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לאשר את האפקטיביות של אבלציה לייזר(כלומר,היעדרות, או מספר מופחת באופן משמעותי של, תאים פלואורסצנטיים באזור מוקרן בלייזר).
    שים לב: גם לאחר הקרנה, תאים פלואורסצנטיים מסוימים עדיין ניתן לראות בשל תחילת מאוחר יותר של ביטוי גנים Gal4 בתאים שהבדלו לאחר אבלציה.
  9. לאחר הקלטת התנהגות הזחל, כדי לפצות על חוסר האחידות ברקע, בצע חלוקת פיקסל אחר פיקסל של כל פריים בתמונה ממוצעת בפיג'י: לחץ על 'תהליך', 'מחשבון תמונה', 'פעולה: חילוק', 'תוצאה של 32 סיביות(ציפה)' ו-'אישור'. כדי ליצור תמונה ממוצעת, לחץ על 'תמונה', 'ערימות', 'Z-Project', 'עוצמה ממוצעת' ו'אישור' (איור 1E, F).
  10. ספור את מספר הפרמציה שנותרה בתא על-ידי לחיצה על 'נתח', 'נתח חלקיקים', הגדרת טווח שטח המכסה את כל הפרמציה, בדיקת תיבת הסימון 'הצג:מסיכות' ולחיצה על 'אישור'. האפשרות 'הצג:מסכות' תספק תמונת פרמסיה מופקת (איור 1G), עם רשימה של מספר החלקיקים (paramecia) בכל פריים.
  11. תכנן את מספר הפרמציה שנותרה בתא ההקלטות לאורך זמן. מכיוון שההערכות לגבי מספר הפרמציה רועשות, אנו ממליצים לבצע ממוצע נע בכל נקודה בטווח של 600 מסגרות (דקה אחת) בגיליון האלקטרוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
איור 1. טרף ללכוד assay ונתונים מייצגים בזחלים זברה-ablated לייזר. (A)מערכת הקלטה התנהגותית. הסטריאומיקרוסקופ היה מצויד במצלמת CMOS. תמונות נרכשו באמצעות קובץ Script בהזמנה אישית. (B)רכיבים של מערכת התאורה. נייר בצבע אפור, מפזר זכוכית, אור טבעת LED לבן, מפזר, מרווח בהתאמה אישית (קרטון) ומפזר עם חור במרכז. (ג)מערכת התאורה שהורכבה מהחלקים המוצגים בתא ההקלטה של B.(D)לבדיקת לכידת הטרף. תא (קוטר: 20 מ"מ; עומק: 2.5 מ"מ) הונח על מגלשת זכוכית. החותם העליון המקורי של התא היה קלוף. כיסוי זכוכית הונח בתא ההקלטה. (ה)תמונה גולמית ממסגרת של הסרט המוקלט. (F) מסגרת המחולקת (פיקסל אחר פיקסל) בתמונה ממוצעת בסרט. שים לב שניתן לפצות על הרקע הלא אחיד בתאורה על-ידי עיבוד תמונה זה. (G) פרמציה שחולצה ממסגרת באמצעות הפונקציה "ניתוח חלקיקים" בפיג'י. (H) דוגמה לתמונה בפיג'י עם סף שהוחל. פרמסיה נראית בהירה, בעוד שעיני זחל הזברה נראות כהות, והרקע אפור. שינויים בתנוחות העין (כלומר,זוויות ביחס לציר הגוף) ניתן לחשב, במידת הצורך. (I)נתונים ניסיוניים מייצגים של צריכת פרמציום בזחל בקרה מנופח של נורת חוש הריח (OB) וזחל מנופח (PT). אבלציה Pretectum הפחיתה באופן משמעותי את יכולת ציד הטרף בעוד אבלציה הנורה חוש הריח לא השפיע על זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Imageing Chambers Grace Bio-Labs CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5 Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0  Hamamatsu Photonics Model:C11440-22CU  A scientific CMOS camera
SZX7 Olympus Stereoscope
A ring LED light CCS   Model: LDR2-100SW2-LA White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth Molecular Probes Catalogue # S-24732 Used as a recording chamber in Ca imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

ערך ריק הנפקה
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter