Overview
このビデオでは、獲物捕獲アッセイについて説明します。ビデオでは、特定のニューロンのレーザーアブレーション後のゼブラフィッシュ幼虫の獲物捕獲挙動を研究する方法について説明しています。
Protocol
1. レーザーアブレーション後の行動の影響評価
- ビデオカメラを搭載したステレオスコープで構成される行動記録システムを設定します。適切な画像取得ソフトウェア、商用またはカスタムメイドのカメラを使用します(図1A)。
- 画像処理でパラメシウムを検出できるように、照明条件を最適化します。たとえば、スペーサを使用してリング白色LEDライトを使用します(図1B)。
注:LEDからの距離と角度は、サンプルの外観(つまり、暗い背景で明るい、または明るい背景の暗い)に影響を与え、したがって、画像処理を成功させるために重要です。スペーサーの最適な高さを決定します(図1C)。 - 元の上部シールを取り除いた行動記録室(ガラススライドに取り付けられていた)にゼブラフィッシュの幼虫(セクション1で説明したレーザーアブレーション実験から回収)を入れる(図1D)。
- マイクロピペットを使用してビーカーから水中に懸濁した50個のパラメシアを収集し、記録チャンバーに入れます。
- 記録室の上にカバースリップを置きます。チャンバーに空気を導入しないように、記録室の水面に置く前に、カバースリップに少量の水を入れてください。
注:このステップでは、パラメシアを含む水が記録室からあふれ出ます。記録室内のパラメシアの残りの数は約30-40になります。 - 照明システム(図1D)に記録チャンバー(幼虫とパラメシアを含む)を配置します。
- 11 分間(6,600 フレーム)のタイムラプス記録を 10 fps で開始します。
- (オプション)行動検査を受けた幼虫ごとに、レーザーアブレーション領域の蛍光を蛍光顕微鏡で観察し、レーザーアブレーションの有効性を確認します(すなわち、レーザー照射領域における蛍光細胞の欠失、または有意に減少した数)。
注:照射後も、アブレーション後に分化した細胞内でのGal4遺伝子発現の後の発症により、いくつかの蛍光細胞が観察される可能性があります。 - 幼虫の挙動を記録した後、背景の均一性の欠如を補うために、フィジーの平均画像で各フレームのピクセル単位の分割を実行します:'プロセス'、'画像電卓'、'演算:分割'、'32ビット(float)結果'、および'OK'。平均的な画像を作成するには、「イメージ」「スタック」「Z-Project」「平均強度」「OK」をクリックします(図1E、F)。
- 「解析」「パーティクルを解析」をクリックし、すべてのパラメカを覆う領域範囲を設定し、「Show:Masks」チェックボックスをオンにして「OK」をクリックして、チャンバーに残されたパラメシアの数を数えます。「Show:Masks」オプションは、各フレーム内のパーティクルの数(パラメシア)のリストを含む抽出されたパラメシア画像(図1G)を提供します。
- 時間をかけて記録室に残されたパラメシアの数をプロットします。パラメシアの数の推定値は騒々しいため、スプレッドシート上の 600 フレーム (1 分) の範囲の各ポイントで移動平均を実行することをお勧めします。
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Representative Results
図 1.レーザーアブレーションゼブラフィッシュ幼虫の獲物捕獲アッセイと代表的なデータ。(A)行動記録システム。実体顕微鏡にはCMOSカメラを搭載。画像は、カスタムスクリプトを使用して取得されました。(B) 照明システムのコンポーネント。灰色の紙、ガラスのディフューザー、白いLEDリングライト、ディフューザー、カスタムメイドのスペーサー(段ボール)、中央に穴のあるディフューザー。(C)B(D) 捕食用記録室に示す部品から組み立てられた照明システム。チャンバー(直径:20mm、深さ:2.5mm)をガラススライドに設置しました。チャンバーの元の上部シールは剥がれました。記録室にガラスカバーを置いた。(E)録画した動画のフレームからの生画像。(F) 動画の平均画像で(ピクセル単位で)分割されたフレーム。なお、この画像処理により、照明の不一様背景を補正することができることに注意してください。(G) フィジーの「粒子分析」機能を使用してフレームから抽出されたパラメシア。(H) 適用されたしきい値を持つフィジーの画像の例。パラメシアは明るく見えますが、ゼブラフィッシュの幼虫の目は暗く見え、背景は灰色です。眼の位置(すなわち、身体軸に対する角度)の変化は、必要に応じて計算することができる。(I) 嗅球アブレート対照幼虫(OB)および前腸アブラト幼虫(PT)におけるパラメシウム消費量の代表的な実験データ。プレテクタムアブレーションは獲物の狩猟能力を大幅に低下させたが、嗅球切れはそれに影響を与えなかった。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Model:C11440-22CU | A scientific CMOS camera |
| SZX7 | Olympus | Stereoscope | |
| A ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
