Overview
이 비디오는 먹이 캡처 분석에 대해 설명합니다. 비디오는 특정 뉴런의 레이저 절제 후 제브라피시 애벌레의 먹이 캡처 행동을 연구하는 방법에 대해 설명합니다.
Protocol
1. 레이저 절제 다음 행동 결과의 평가
- 비디오 카메라가 장착된 스테레오스코프로 구성된 행동 기록 시스템을 설정합니다. 적절한 이미지 획득 소프트웨어, 상업적 또는 맞춤제작(그림 1A)이있는 카메라를 사용합니다.
- 이미지 처리에 의해 파라메슘을 감지할 수 있도록 조명 조건을 최적화합니다. 예를 들어 스페이서(도1B)와함께 링 화이트 LED 라이트를 사용합니다.
참고: LED의 거리및 각도로부터의 거리는샘플(즉,어두운 배경에서 밝거나 밝은 배경의 어두운 색)의 모양에 영향을 미치므로 성공적인 이미지 처리에 매우 중요합니다. 스페이서의 가장 높이를 결정합니다(도1C). - 제브라피쉬 애벌레(제1항에 기재된 레이저 절제 실험에서 회수)를 원래 상단 씰제거(도1D)와함께 행동 기록 챔버(유리 슬라이드에 부착됨)에 놓습니다.
- 마이크로 피펫을 사용하여 비커에서 물에 매달린 50 개의 파라메시아를 수집하고 녹음 실에 놓습니다.
- 레코딩 챔버 위에 커버 슬립을 놓습니다. 챔버에 공기를 도입하지 않도록 기록 챔버의 수면에 배치하기 전에 커버 슬립에 약간의 물 방울을 넣어.
참고: 이 단계에서 는 파라메시아가 있는 일부 물이 기록실에서 넘쳐납니다. 기록 챔버의 나머지 파라메시아 수는 약 30-40입니다. - 조명시스템(도 1D)에레코딩 챔버(애벌레 및 파라메시아포함)를 배치합니다.
- 11분(6,600프레임)에 10fps로 타임랩스 레코딩을 시작합니다.
- (선택 사항) 거동을 위해 시험된 각 애벌레에 대해, 형광 현미경검사법에 의한 레이저 압착 영역의 형광을 관찰하여 레이저 절제의 효과를확인한다(즉,레이저 조사 영역에서 형광세포의 부재, 또는 현저히 감소된 수).
참고: 조사 후에도 일부 형광 세포는 절제 후 분화된 세포에서 Gal4 유전자 발현의 나중에 발병하기 때문에 여전히 관찰 될 수 있습니다. - 애벌레의 동작을 기록한 후 배경에서 균일성의 부족을 보정하고 피지의 평균 이미지로 각 프레임의 픽셀별 분할을 수행합니다: '프로세스', '이미지 계산기', '조작: 분할', '32비트(플로트) 결과', 'OK'를 클릭합니다. 평균 이미지를 만들려면 '이미지', '스택', 'Z 프로젝트', '평균 강도', 'OK'(그림1E, F)를클릭합니다.
- '분석', '입자 분석'을 클릭하고, 모든 파라메시아를커버하는 영역 범위를 설정하고, '표시:마스크' 확인란을 확인하고, 'OK'를 클릭하여 챔버에 남아 있는 파라메시아 수를 계산합니다. 'Show:Masks' 옵션은 각 프레임에 입자수(파라메시아)목록이 있는 추출된 파라메시아 이미지(그림1G)를제공합니다.
- 시간이 지남에 따라 기록 챔버에 남아있는 파라메시아의 수를 플롯합니다. 파라메시아 수의 추정치는 시들하기 때문에 스프레드시트의 600프레임(1분) 범위에서 각 지점에서 이동 평균을 수행하는 것이 좋습니다.
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Representative Results
그림 1. 레이저 압단 제브라피시 애벌레의 먹이 캡처 분석 및 대표적인 데이터. (A)행동 기록 시스템. 스테레오현미경에는 CMOS 카메라가 장착되어 있습니다. 이미지는 맞춤 제작 스크립트를 사용하여 획득되었습니다. (B)조명 시스템의 구성 요소. 회색 색 종이, 유리 디퓨저, 화이트 LED 링 라이트, 디퓨저, 맞춤형 스페이서(골판지) 및 중앙에 구멍이 있는 디퓨저. (C)B.(D)레코딩 챔버에 표시된 부품으로부터 조립된 조명 시스템이 먹이 포착 분석. 챔버(직경: 20mm; 깊이: 2.5mm)가 유리 슬라이드에 배치되었습니다. 챔버의 원래 상단 씰이 벗겨졌습니다. 녹음실에 유리 커버를 넣었습니다. (E)녹화된 영화의 프레임으로부터 원시 이미지. (F)동영상의 평균 이미지로 분할된 프레임(픽셀별 픽셀)입니다. 조명의 균일하지 않은 배경은 이 이미지 처리에 의해 보상될 수 있습니다. (G)피지의 "입자 분석" 기능을 사용하여 프레임에서 추출된 파라메시아. (H)적용 된 임계 값을 가진 피지에서 이미지의 예. 파라메시아는 밝게 보이지만, 제브라피쉬 애벌레의 눈은 어둡게 나타나고 배경은 회색입니다. 눈 위치의 변화(즉,신체 축에 대하여 각도)를 계산할 수 있습니다. (I)후각전-압하 대조유충(OB) 및 프리텍툼 절제된 애벌레(PT)에서 파라메뮴 소비의 대표적인 실험 데이터. 후각 전구 절제는 영향을 미치지 않는 동안 Pretectum 절제는 먹이 사냥 능력을 크게 감소.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Model:C11440-22CU | A scientific CMOS camera |
| SZX7 | Olympus | Stereoscope | |
| A ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
