Prey Capture Assay: Метод изучения поведения захвата добычи зебры Ларвы

Overview

Это видео описывает анализ захвата добычи. В видео обсуждается метод изучения поведения хищников захвата личинок зебры после лазерной абляции конкретных нейронов.

Protocol

1. Оценка поведенческих последствий после лазерной абляции

1. Настройка поведенческой системы записи, которая состоит из стереоскопа, оснащенного видеокамерой. Используйте камеру с соответствующим программным обеспечением для получения изображений, коммерческим или заказным(рисунок 1A).
2. Оптимизируйте состояние освещения таким образом, чтобы парамеция можно было обнаружить с помощью обработки изображений. Например, используйте кольцо белого светодиодного света с спейсером(рисунок 1B).
   Примечание: Расстояние от светодиода и угол его наклона влияет на внешний вид образца(т.е.яркий на темном фоне или темный на ярком фоне) и поэтому имеют решающее значение для успешной обработки изображений. Определите лучшую высоту спейсера(рисунок 1C).
3. Поместите личинку зебры (восстановленную в результате эксперимента по лазерной абляции, описанного в разделе 1) в поведенческую камеру записи (которая была прикреплена к стеклянной горке) с удаленным исходным верхним уплотнением(рисунок 1D).
4. Соберите 50 парамеции, подвешенной в воде из стакана с помощью микропипета, и поместите их в камеру записи.
5. Поместите крышку скольжения на верхней части камеры записи. Положите небольшую каплю воды на крышку скольжения перед размещением на поверхности воды записи камеры, чтобы избежать введения воздуха в камеру.
   Примечание: На этом этапе, немного воды с парамецией будет переполнения из камеры записи. Оставшееся количество парамеции в камере записи составит примерно 30-40.
6. Поместите камеру записи (содержащую личинку и парамецию)в систему освещения(рисунок 1D).
7. Запуск замедленной записи на 10 кадров в секунду в течение 11 минут (6600 кадров).
8. (По желанию) Для каждой личинки, которая была протестирована на поведение, наблюдать флуоресценцию лазерно-абляционных областей флуоресцентной микроскопии, чтобы подтвердить эффективность лазерной абляции(т.е.отсутствие, или значительно уменьшенное количество флуоресцентных клеток в лазерно-облученной области).
   Примечание: Даже после облучения, некоторые флуоресцентные клетки все еще можно наблюдать из-за более позднего начала экспрессии гена Gal4 в клетках, которые дифференцированы после абляции.
9. После записи поведения личинки, чтобы компенсировать отсутствие единообразия в фоновом режиме, выполните пиксельное разделение каждого кадра на среднее изображение на Фиджи: нажмите 'Process', 'Image Calculator', 'Operation: Divide', '32-bit (float) result' и 'OK'. Чтобы сделать среднее изображение, щелкните 'Изображение', 'Стеки', 'К-Проект', 'Средняя интенсивность' и 'OK'(Рисунок 1E, F).
10. Подсчитайте количество парамеции, оставленных в камере, нажав кнопку "Анализ", "Анализ частиц", установив диапазон области, который охватывает все парамеции, проверка "Показать: Маски" флажок, и нажав "ОК". Опция 'Show:Masks' обеспечит извлеченное изображение парамеции (рисунок 1G),со списком количества частиц(парамеция)в каждом кадре.
11. Участок количество парамеции оставили в камере записи с течением времени. Поскольку оценки количества парамеции шумные, мы рекомендуем выполнять движущийся средний по каждой точке в диапазоне 600 кадров (1 мин) на электронной таблице.

Representative Results

Рисунок 1. Анализ добычи и репрезентативные данные в лазерных личинках зебры. (A)Поведенческая система записи. Стереомикроскоп был оснащен камерой CMOS. Изображения были приобретены по индивидуальному сценарию. (B)Компоненты системы освещения. Бумага серого цвета, стеклянный диффузор, белый светодиодный свет кольца, диффузор, изготовленный на заказ космический (картон) и диффузор с отверстием в центре. (C) Система освещения, собранная из частей, показанных в B. (D) Запись камеры для анализа захвата добычи. Камера (диаметр: 20 мм; глубина: 2,5 мм) была помещена на стеклянную горку. Первоначальная верхняя печать камеры была очищена. На камеру звукозаписи была надета стеклянная крышка. (E)Сырье изображение из кадра записанного фильма. (F)Кадр, разделенный (пиксель за пикселем) на среднее изображение в фильме. Обратите внимание, что не однородный фон в освещении может быть компенсирован этой обработкой изображений. (G) Парамеция, извлеченная из кадра с помощью функции "Анализ частиц" на Фиджи. (H)Пример изображения на Фиджи с прикладным порогом. Парамеция кажется яркой, в то время как глаза личинки зебры кажутся темными, а фон серый. Изменения в положениях глаз(т.е.углы по отношению к оси тела) могут быть рассчитаны, если это необходимо. (I)Репрезентативные экспериментальные данные потребления парамеция в обонятельной лампы-абляционной личинки управления (OB) и претектум-абляционной личинки (PT). Предтехная абляция значительно снизила способность охоты на добычу, в то время как обонятельная абляция луковицы не повлияла на нее.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	Model:C11440-22CU	A scientific CMOS camera
SZX7	Olympus		Stereoscope
A ring LED light	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging