Prey Capture Assay: En metod för att studera zebrafisk larvens bytesfångstbeteende

Overview

Den här videon beskriver bytesfångstanalysen. Videon diskuterar metoden för att studera bytesfångstbeteende hos zebrafisklarver efter laserablation av specifika nervceller.

Protocol

1. Bedömning av beteendemässiga konsekvenser efter laserablation

1. Konfigurera ett beteendeinspelningssystem som består av ett stereoscope utrustat med en videokamera. Använd en kamera med lämplig programvara för bildförvärv, kommersiell eller skräddarsydd (figur 1A).
2. Optimera belysningsförhållandet så att parameciumet kan detekteras genom bildbehandling. Använd till exempel en ringvit LED-lampa med en distans (Bild 1B).
   Anmärkning: Avståndet från och vinkeln på lysdioden påverkarprovet (dvs. ljust imörk bakgrund eller mörkt i ljus bakgrund) och är därför avgörande för framgångsrik bildbehandling. Bestäm distansens bästa höjd (bild 1C).
3. Placera en zebrafisk larva (återvunnen från laserablationsexperimentet som beskrivs i avsnitt 1) i en beteendemässig inspelningskammare (som var fäst vid en glasbild) med den ursprungliga toppförseglingen borttagen (figur 1D).
4. Samla 50 paramecia upphängda i vatten från bägaren med hjälp av en mikropipett och placera dem i inspelningskammaren.
5. Placera en täcksping ovanpå inspelningskammaren. Lägg en liten droppe vatten på täcksläppet innan du placerar på inspelningskammarens vattenyta för att undvika att föra in luft i kammaren.
   Anmärkning: I det här steget kommer lite vatten med paramecia att flöda över från inspelningskammaren. Det återstående antalet paramecia i inspelningskammaren kommer att vara cirka 30-40.
6. Placera inspelningskammaren (som innehåller en larva och paramecia)i belysningssystemet (figur 1D).
7. Starta timelapse-inspelningen med 10 fps i 11 min (6 600 bildrutor).
8. (Valfritt) För varje larva som testades för beteende, observera fluorescensen i de laserabla områdena genom fluorescerande mikroskopi för att bekräfta effektiviteten hos laserablationen (dvs.frånvaro eller signifikant minskat antal fluorescerande celler i det laserbestrålade området).
   Anmärkning: Även efter bestrålning kan vissa fluorescerande celler fortfarande observeras på grund av senare uppkomsten av Gal4 genuttryck i celler som differentierade efter ablation.
9. Efter att ha spelat in larvens beteende, för att kompensera för bristen på enhetlighet i bakgrunden, utför en pixel-för-pixel-uppdelning av varje bildruta med en genomsnittlig bild i Fiji: klicka på "Process", "Bildkalkylator", "Operation: Divide", "32-bitars (float)resultat" och "OK". Om du vill skapa en genomsnittlig bild klickar du på 'Bild', 'Stacks', 'Z-Project', 'Average intensity' och 'OK' (Bild 1E, F).
10. Räkna antalet paramecia som finns kvar i kammaren genom att klicka på "Analysera", "Analysera partiklar", ställa in ett områdesområde som täcker hela paramecian, kontrollera kryssrutan "Visa:Masker" och klicka på "OK". Alternativet "Visa:Masker" ger en extraherad parameciabild (figur 1G), med en lista över antalet partiklar (paramecia) i varje bildruta.
11. Plotta antalet paramecia kvar i inspelningskammaren över tiden. Eftersom uppskattningarna av antalet paramecia är bullriga rekommenderar vi att du utför ett glidande medelvärde för varje punkt i ett intervall på 600 bildrutor (1 min) i kalkylbladet.

Representative Results

Figur 1. Byte fånga analys och representativa data i laser-ablated zebrafisk larver. (A) Beteenderegistreringssystem. Stereomikroskopet var utrustat med en CMOS-kamera. Bilder förvärvades med hjälp av ett skräddarsyt skript. B)Komponenter i belysningssystemet. Ett gråfärgat papper, en glasspridare, vitt LED-ringljus, diffusor, en specialtillverkad distans (kartong) och diffusor med ett hål i mitten. C)Belysningssystemet monterat från de delar som visas i B.(D)Inspelningskammare för bytesfångsttestet. En kammare (diameter: 20 mm; djup: 2,5 mm) placerades på en glasrutschbana. Kammarens ursprungliga topptätning skalades av. Ett glasskydd sattes på inspelningskammaren. (E) Rå bild från en ram av den inspelade filmen. (F) En bildruta dividerad (pixel för pixel) med en genomsnittlig bild i en film. Observera att den icke-enhetliga bakgrunden i belysning kan kompenseras av denna bildbehandling. G) Paramecia extraheras från en ram med funktionen "Partikelanalys" i Fiji. (H) Exempel på bild i Fiji med en tillämpad tröskel. Paramecia verkar ljus, medan zebrafiskens larvas ögon verkar mörka och bakgrunden är grå. Förändringar i ögonpositioner (dvs.vinklar med avseende på kroppsaxeln) kan vid behov beräknas. (I) Representativa experimentella data om parameciumförbrukning i en olfaktorisk glödlampa-ablated kontroll larva (OB) och en pretectum-ablated larva (PT). Pretectum ablation minskade avsevärt byte jakt förmåga medan lukt glödlampa ablation påverkade det inte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	Model:C11440-22CU	A scientific CMOS camera
SZX7	Olympus		Stereoscope
A ring LED light	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging