Escape Response Assay: een methode om de reactie van zebravislarven te bestuderen om stimuli aan te raken

Overview

Deze video beschrijft de touch-evoke responstest, die de reactie van de zebravislarve op aanraakprikkels meet.

Protocol

1. Aanraak-opgeroepen reactietest

1. Voorbereiding van 2 dpf Embryo's voor Touch-evoked Response Assay
   1. Zorg ervoor dat het tijdstip van de dag waarop de test wordt uitgevoerd consistent is tussen experimenten, omdat de activiteit gedurende de dag dramatisch kan variëren.
      OPMERKING: Het experiment moet geblindeerd worden uitgevoerd en de volgorde van testen moet worden gerandomiseerd om experimentele artefacten te minimaliseren.
   2. Wijs de visstammen een getal toe, dat onbekend is bij de persoon die het experiment uitvoert. Hierna genereert het gebruik van vrij beschikbare online tools een willekeurige lijst die de volgorde van testen dicteert.
   3. Dechorioneer embryo's ten minste een uur voor het testen door een gat in het koraal te scheuren en het koraal voorzichtig uit elkaar te trekken met een fijn pincet. Verwijder vuil uit de petrischaal voordat u terugkeert naar de incubator van 28 °C.
2. Touch-evoked Response Assay uitvoeren
   1. Hittefase tot 28 °C ten minste 15 minuten voor aanvang van de test.
      OPMERKING: Deze fase is temperatuurgestuurd en blijft gedurende de test op 28 °C. Temperatuur heeft invloed op de activiteit en het is daarom belangrijk om een constante temperatuur te handhaven. Als er geen verwarmd stadium beschikbaar is, moet de temperatuur van het water worden gecontroleerd en moeten alle experimenten op dezelfde temperatuur worden uitgevoerd.
   2. Plaats een petrischaal gevuld met embryomedium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄ in water) op een verlicht podium en monteer de hogesnelheidscamera over de petrischaal.
   3. Start de videocamera-opnamesoftware (zoals Stream Pix 5, hier beschreven) en selecteer onder het tabblad "werkruimte" 1.000 frame per seconde (1.000 fps) als opnamesnelheid om ervoor te zorgen dat de snelle zwemactie van de vis wordt opgenomen.
   4. Werk met één embryo tegelijk en plaats het embryo in het midden van de petrischaal met de zebravis duidelijk zichtbaar in het gezichtsveld.
      OPMERKING: Als het embryo voor aanvang van het experiment wegzwemt, vervang het dan door een ander embryo, omdat herovering en positionering van het embryo ertoe kunnen leiden dat het ongevoelig wordt voor de stimulus en herhaalde barstreacties spierzwakte in sommige ziektemodellen kunnen bevorderen.
   5. Begin met opnemen door op de knop "opnemen" te klikken en lever de mechanosensorische stimulus aan het embryo door het zachtjes aan te raken met een stompe naald op de bovenkant van het hoofd.
   6. Stop de opname nadat het embryo uit het gezichtsveld is gezwommen of weer tot rust is gekomen.
      OPMERKING: De versnelling piekt binnen de eerste 0,2 sec van de burst escape respons na de mechanische stimulus. Zorg er daarom voor dat de vis zich ten minste gedurende de eerste 0,2 seconde van de ontsnappingsrespons die de vis registreert, in het gezichtsveld bevindt. Met behulp van de software Stream Pix 5 worden de gegevens automatisch opgeslagen als een .avi videobestand. Alternatieve video-opnamesoftware zoals Free Video Capture of Softonic, die beide vrij beschikbaar zijn om te downloaden, kan ook worden gebruikt.
   7. Breng het embryo terug naar een nieuwe petrischaal en selecteer een ander embryo om te testen. Voer tests uit op minimaal 15 vissen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products	PT S90001
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
High Speed Camera	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2