Escape Response Assay: Une méthode pour étudier la réponse de larve zebrafish aux stimuli tactiles

Overview

Cette vidéo décrit l’analyse de réponse tactile, qui mesure la réponse de la larve de poisson zèbre aux stimuli tactiles.

Protocol

1. Analyse de réponse évoquée au toucher

1. Préparation de 2 embryons dpf pour l’analyse de réponse évoquée au toucher
   1. Assurez-vous que l’heure de la journée à laquelle le test est effectué est compatible entre les expériences parce que l’activité peut varier considérablement tout au long de la journée.
      REMARQUE: L’expérience doit être effectuée aveuglée et l’ordre de tester randomisé pour minimiser les artefacts expérimentaux.
   2. Attribuez aux souches de poissons un certain nombre, ce qui est inconnu de l’individu qui effectue l’expérience. Par la suite, l’utilisation d’outils en ligne disponibles gratuitement génère une liste aléatoire qui dicte l’ordre des tests.
   3. Au moins une heure avant le test, déchorionner les embryons en déchirant un trou dans la chorion et en tirant doucement le chorion à l’aide d’une paire de pinces fines. Retirer les débris de la boîte de Pétri avant de retourner à l’incubateur de 28 °C.
2. Effectuer l’essai de réponse touch-évoqué
   1. Chauffer le stade à 28 °C au moins 15 minutes avant de commencer les essais.
      REMARQUE: Cette étape est contrôlée par la température et restera à 28 °C pendant toute la durée de l’essai. La température affectera l’activité et il est donc important de maintenir une température constante. Si un stade chauffé n’est pas disponible, la température de l’eau doit être surveillée et toutes les expériences doivent être menées à la même température.
   2. Placez une boîte de Pétri remplie de milieu embryonnaire (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO 4 dans_l’eau) sur une scène illuminée et montez la caméra à grande vitesse au-dessus de la boîte de Pétri.
   3. Lancez le logiciel d’enregistrement de caméra vidéo (comme Stream Pix 5, décrit ici) et sous l’onglet « espace de travail » sélectionnez 1000 images par seconde (1000 fps) comme la vitesse de capture pour s’assurer que l’action de natation rapide du poisson est enregistrée.
   4. En travaillant avec un embryon à la fois, placez l’embryon au milieu de la boîte de Pétri avec le poisson zèbre clairement visible dans le champ de vision.
      REMARQUE: Si l’embryon nage avant le début de l’expérience, le remplacer par un autre, car la récupération et le positionnement de l’embryon peuvent l’entraîner une désensibilisation au stimulus et des réponses répétées à l’éclatement peuvent favoriser la faiblesse musculaire dans certains modèles de la maladie.
   5. Commencez à enregistrer en cliquant sur le bouton « enregistrer » et, livrer le stimulus mécanosensoriel à l’embryon en le touchant doucement avec une aiguille contondante sur le dessus de la tête.
   6. Arrêtez l’enregistrement après que l’embryon a nagé hors du champ de vision ou est retourné au repos.
      REMARQUE: L’accélération atteint des sommets dans les 0,2 s de la réponse d’évacuation d’éclatement suivant le stimulus mécanique. Par conséquent, assurez-vous qu’au moins pendant les 0,2 seconde de la réponse d’évacuation enregistrant le poisson est dans le champ de vision. À l’aide du logiciel Stream Pix 5, les données seront automatiquement enregistrées sous forme .avi fichier vidéo. D’autres logiciels de capture vidéo tels que Free Video Capture ou Softonic, qui sont tous deux disponibles gratuitement pour téléchargement, pourraient également être utilisés.
   7. Retournez l’embryon dans une nouvelle boîte de Pétri et sélectionnez un autre embryon pour analyse. Effectuez des tests sur un minimum de 15 poissons.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products	PT S90001
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
High Speed Camera	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2