Ensayo de respuesta de escape: un método para estudiar la respuesta de larva de pez cebra para tocar estímulos

Overview

Este video describe el ensayo de respuesta touch-evoke, que mide la respuesta de la larva de pez cebra para tocar estímulos.

Protocol

1. Ensayo de respuesta evocado por el tacto

1. Preparación de 2 embriones dpf para ensayos de respuesta evocados por el tacto
   1. Asegúrese de que la hora del día a la que se lleva a cabo la prueba sea consistente entre experimentos porque la actividad puede variar drásticamente a lo largo del día.
      NOTA: El experimento debe realizarse cegado y el orden de las pruebas aleatorias para minimizar los artefactos experimentales.
   2. Asignar el pez tensa un número, que es desconocido para el individuo que lleva a cabo el experimento. Después de esto, el uso de herramientas en línea disponibles libremente genera una lista aleatoria que dicta el orden de las pruebas.
   3. Al menos una hora antes de las pruebas, desconoja los embriones rompiendo un agujero en el coral y separando suavemente la carrocolán usando un par de pinzas finas. Retire los residuos de la placa de Petri antes de volver a la incubadora de 28 °C.
2. Realización de ensayos de respuesta evocados por el tacto
   1. Etapa de calor a 28 °C al menos 15 minutos antes de comenzar las pruebas.
      NOTA: Esta etapa está controlada por temperatura y permanecerá a 28 °C durante la duración de la prueba. La temperatura afectará a la actividad y por lo tanto es importante mantener una temperatura constante. Si no se dispone de una etapa calentada, se debe controlar la temperatura del agua y realizar todos los experimentos a la misma temperatura.
   2. Coloque una placa de Petri llena de medio embrionario (5 mM NaCl, 0,17mM KCl, 0,33 mM CaCl_2,0,33 mM MgSO₄ en agua) en un escenario iluminado y monte la cámara de alta velocidad sobre la placa petri.
   3. Inicie el software de grabación de la cámara de vídeo (como Stream Pix 5, descrito aquí) y bajo la pestaña "espacio de trabajo" seleccione 1.000 fotogramas por segundo (1.000 fps) como la velocidad de captura para asegurarse de que se graba la acción de natación rápida del pez.
   4. Trabajando con un embrión a la vez, coloque el embrión en medio de la placa de Petri con el pez cebra claramente visible en el campo de visión.
      NOTA: Si el embrión nada antes del comienzo del experimento, reemplácelo por otro, ya que la recaptura y el posicionamiento del embrión pueden provocar que se desensibilice al estímulo y las repetidas respuestas de ráfagas pueden promover la debilidad muscular en algunos modelos de enfermedad.
   5. Comience a grabar haciendo clic en el botón "grabar" y, entregue el estímulo mecanosensosensorial al embrión tocándolo suavemente con una aguja contundente en la parte superior de la cabeza.
   6. Detenga la grabación después de que el embrión haya salido del campo de visión o haya vuelto a descansar.
      NOTA: La aceleración alcanza su punto máximo dentro de los primeros 0,2 segundos de la respuesta de escape de ráfaga después del estímulo mecánico. Por lo tanto, asegúrese de que al menos durante los primeros 0,2 segundos de la respuesta de escape que registra el pez está en el campo de visión. Utilizando el software Stream Pix 5, los datos se guardarán automáticamente como un archivo de vídeo .avi. También se podría utilizar software alternativo de captura de vídeo como Free Video Capture o Softonic, ambos disponibles libremente para su descarga.
   7. Devuelve el embrión a una nueva placa de Petri y selecciona otro embrión para realizar pruebas. Realizar pruebas en un mínimo de 15 peces.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products	PT S90001
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
High Speed Camera	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2