Escape Response Assay: En metod för att studera svaret från Zebrafish Larva för att röra Stimuli

Overview

Denna video beskriver beröring-framkalla svarsanalysen, som mäter svaret från zebrafisk larven för att röra stimuli.

Protocol

1. Berörings-framkallad svarsanalys

1. Beredning av 2 dpf embryon för beröring-framkallad svarsanalys
   1. Se till att den tid på dagen då testet utförs är konsekvent mellan experiment eftersom aktiviteten kan variera dramatiskt under dagen.
      OBS:Experimentet bör utföras förblindat och testordningen randomiseras för att minimera experimentella artefakter.
   2. Tilldela fiskstammarna ett antal, vilket är okänt för den person som utför experimentet. Efter detta genererar användning av fritt tillgängliga onlineverktyg en slumpmässig lista som dikterar testordningen.
   3. Minst en timme före testningen dechorionate embryon genom att riva ett hål i chorion och försiktigt dra chorion isär med hjälp av ett par fina pincett. Ta bort skräp från petriskålen innan du återgår till inkubatorn på 28 °C.
2. Utföra touch-framkallad svarsanalys
   1. Värmesteg till 28 °C minst 15 minuter innan provningen påbörjas.
      OBS:Detta steg är temperaturkontrollerat och kommer att ligga kvar på 28 °C under hela provningen. Temperaturen kommer att påverka aktiviteten och det är därför viktigt att hålla en konstant temperatur. Om ett uppvärmt stadium inte är tillgängligt bör vattnets temperatur övervakas och alla experiment utföras vid samma temperatur.
   2. Placera en petriskål fylld med embryomedium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄ i vatten) på en upplyst scen och montera höghastighetskameran över petriskålen.
   3. Starta videokamerainspelningsprogramvaran (till exempel Stream Pix 5, som beskrivs här) och under fliken "arbetsyta" väljer du 1 000 bildrutor per sekund (1 000 fps) som fångsthastighet för att säkerställa att fiskens snabba simning spelas in.
   4. Arbeta med ett embryo i taget, placera embryot i mitten av petriskålen med zebrafisken tydligt synlig i synfältet.
      OBS:Om embryot simmar bort innan experimentet påbörjas, ersätt det med ett annat, eftersom rekapitning och positionering av embryot kan leda till att det blir okänsligt för stimulansen och upprepade burst-svar kan främja muskelsvaghet i vissa sjukdomsmodeller.
   5. Börja spela in genom att klicka på "spela in" -knappen och leverera mekanosensorisk stimulans till embryot genom att röra det försiktigt med en trubbig nål på toppen av huvudet.
   6. Stoppa inspelningen när embryot har simmat ut ur synfältet eller återvänt till vila.
      OBS:Accelerationen toppar inom de första 0,2 sekunderna av burst-utrymningsresponsen efter den mekaniska stimulansen. Se därför till att åtminstone under de första 0,2 sekunderna av utrymningssvaret som registrerar fisken är inom synfältet. Med hjälp av programvaran Stream Pix 5 sparas data automatiskt som en .avi videofil. Alternativ videoinspelningsprogram som Free Video Capture eller Softonic, som båda är fritt tillgängliga för nedladdning, kan också användas.
   7. Sätt tillbaka embryot i en ny petriskål och välj ett annat embryo för testning. Utför tester på minst 15 fiskar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products	PT S90001
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
High Speed Camera	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2