Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

חילוץ DNA מקליפ זנב: שיטה המשמשת Genotyping זברה

Overview

מאמר זה מתאר מיצוי DNA מקליפ זברה- דג זנב. הפרוטוקול מדגים שיטה מהירה ויעילה לניתוח גנוטיפים של דגי זברה.

Protocol

1. הכנת DNA

  1. הכן מאגר תמוגה DNA: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40. הוסיפו פרוטאין K טרי לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל ביום השימוש.
  2. איסוף רקמות:
    1. עבור קליפ סנפיר דגים למבוגרים:
      1. להשהות דגים: מניחים את הדג בתמיסה 0.004% MS-222 (tricaine). חכה עד שתנועת הגיל תאט.
      2. שים דגים על ערימה של 5-10 קימוויפס וחתך חתיכה קטנה של סנפיר הזנב, על 2-3 מ"מ, עם סכין גילוח סטרילי.
      3. במהירות למקם את הדגים במיכל שכותרתו עם מים מתוקים להתאוששות; בזהירות תווית הן את הטנק ואת הצינור המתאים שיכיל את קליפ הסנפיר. לשנות את המים ולהאכיל את הדגים כל יומיים.
      4. להרים את קליפ סנפיר עם קצה פיפטה סטרילי ולהעביר אותו לתוך צינור מלא 100 μl מאגר תמוגה DNA.
      5. השלך את קצה הפיפט והשליך את סכין הגילוח לתוך מיכל חד.
    2. עבור קליפ זנב עובר:
      1. מקם עוברים לתוך 0.004% MS-222 (tricaine) פתרון. חכה 2 דקות.
      2. חותכים חתיכת זנב עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ מנתח.
      3. שים את הזנב לתוך צינור שכותרתו מלא 30 μl מאגר תמוגה DNA.
      4. במהירות לשים את העובר לתוך צינור המכיל 100 μl 4% paraformaldehyde.
      5. תווית צינורות עם עוברים וצינורות הזנב המתאימים שלהם.
      6. לאחסן את הצינורות עם עוברים ב 4 מעלות צלזיוס לילה עבור קיבעון.
      7. לנקות את המלקחיים באמצעות מים מילי-Q ו Kimwipes בין כל עובר כדי למזער את הזיהום.
    3. לעוברים שלמים:
      1. מקם עוברים לתוך 0.004% MS-222 (tricaine) פתרון. חכה 2 דקות.
      2. שים 1-5 עוברים בצינור מלא 100 μl מאגר תמוגה DNA. אין צורך בהקלה.
  3. עיכול דנ"א
    דגירה צינורות עם רקמה (סנפיר או זנב קליפים או עוברים) ב 55 °C (69 °F) עבור 4 שעות עד לילה.
  4. השבתת החלבון K
    מחממים צינורות ל 95 °C (70 °F) במשך 15 דקות. DNA יש להשתמש עבור PCR מיד, או מאוחסן ב -20 °C (70 °F) עד 3 חודשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix BioFire HRLS-ASY-0002 www.biofiredx.com
Tricaine 
Paraformaldehyde

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

ערך ריק הנפקה
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter