Summary
Abstract
पूर्व खेती की आवश्यकता के बिना सूक्ष्मजीवों से सटे जीनोमिक दृश्यों के Metagenomic पुस्तकालयों संग्रह के बड़े टुकड़े. बनाने और स्क्रीनिंग metagenomic पुस्तकालयों के लिए एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया उत्पन्न इसलिए असभ्य माइक्रोबियल assemblages के आनुवांशिक और चयापचय गुणों में कुशल उच्च throughput जांच के लिए उपयोगी है. यहाँ कुंजी प्रोटोकॉल वीडियो है, जो हम सही एक लंबी प्रक्रिया है कि एकांतर रोबोट इंस्ट्रूमेंटेशन और (मानव) मैनुअल हस्तक्षेप पर निर्भर करता है का वर्णन करने के लिए सबसे उपयोगी प्रारूप प्रस्ताव है पर प्रस्तुत कर रहे हैं. सबसे पहले, हम रोबोटिक्स रोजगार के लिए उच्च घनत्व macroarray झिल्ली पर पुस्तकालय क्लोन, जिनमें से प्रत्येक चौबीस 384 अच्छी तरह से पुस्तकालय प्लेटें से डुप्लिकेट कालोनियों को शामिल कर सकते हैं हाजिर. स्वचालन सटीकता और गति के लिए ही नहीं इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी पुस्तकालय क्लोनों की एक बड़ी संख्या अत्यधिक घने स्थानिक व्यवस्था में फिट करने के लिए आवश्यक पैमाने के miniaturization के कारण. एक बार उत्पन्न, हम अगले दिखा दिया कैसे macroarray झिल्ली ब्याज की जांच लेबलिंग, झिल्ली संकरण, और संकेत का पता लगाने के लिए मानक प्रोटोकॉल का संशोधित संस्करण का उपयोग जीन के लिए जांच की जा सकती है. हम शामिल कदम की विस्तृत लिखित विवरण और आवश्यक सामग्री है, जो सभी के वीडियो उपलब्ध ऑनलाइन के साथ कर रहे हैं के साथ इन प्रक्रियाओं के दृश्य प्रदर्शन पूरित.
Protocol
1. संकरण प्रक्रिया
एक संकरण ट्यूब 1 या 2 झिल्ली (22 सेमी द्वारा 22 आकार) ले जाएगा. संकरण मिश्रण के 50 मिलीलीटर और संकरण ट्यूब प्रति डीएनए जांच (10 एनजी / एमएल अंतिम एकाग्रता) के 0.5 मिलीग्राम का उपयोग करें. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, जेल - शुद्ध डीएनए जांच के रूप में उपयोग करें. यदि जांच तैयारी स्केलिंग अप, ट्यूबों की संख्या के बजाय ट्यूब प्रति अभिकर्मकों की राशि में वृद्धि की वृद्धि हुई है.
जांच तैयारी (0.5 मिलीग्राम डीएनए):
- पानी की 60 μl के साथ पार linker समाधान के 15 μl पतला.
- पतला करने के लिए डीएनए 10 एनजी / पानी के साथ एक पेंच छाया microtube में 50 μl कुल मात्रा के लिए μl.
- उबलते पानी में 5 मिनट के लिए डीएनए denature.
- तेजी से बर्फ को हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए ठंडा. संक्षेप में स्पिन.
- प्रतिक्रिया बफर के 50 μl जोड़ें और धीरे मिश्रण.
- अभिकर्मक लेबलिंग के 10 μl जोड़ें और धीरे मिश्रण.
- चरण 1 से पतला समाधान पार linker 50 μl जोड़ें और धीरे मिश्रण. धीरे भंवर और संक्षेप में स्पिन.
- 37 डिग्री 30 मिनट के लिए सी सेते हैं.
- को 2 घंटे के लिए लिए बर्फ पर रखें या -20 डिग्री सेल्सियस पर एक 100% ग्लिसरॉल और दुकान के बराबर मात्रा में जोड़ें
नोट: किट के साथ आपूर्ति पानी का उपयोग करें. बर्फ पर सभी अभिकर्मकों रखें जब तक अन्यथा कहा.
झिल्ली तैयारी और संकरण
- पहले से गरम संकरण बफर और संकरण ट्यूब के 50 से 60 मिलीलीटर ° सी.
- संकरण ट्यूब संकरण बफर जोड़ें. रोल झिल्ली (एस) और संकरण ट्यूब को जोड़ने. (यदि ट्यूब प्रति 2 झिल्ली, पूरी तरह से एक झिल्ली के ऊपर पहली रोल जोड़ने, फिर शीर्ष पर अन्य झिल्ली एक ही दिशा में रोल.)
- पर 60 संकरण ट्यूब सेते ° सी के लिए कम से कम आधा एच. (सुनिश्चित करें झिल्ली (ओं) को अच्छी तरह से लथपथ हो.)
- संकरण ट्यूब से लेबल जांच युक्त ट्यूब एक लंबे विंदुक के साथ संकरण बफर के बारे में 1 मिलीलीटर स्थानांतरण. धीरे भंवर और संक्षेप में स्पिन. मिश्रण वापस स्थानांतरण संकरण ट्यूब.
- 60 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
नोट: का प्रयोग करें संदंश और दस्ताने जब झिल्ली से निपटने. संकरण ट्यूबों के मिक्स सामग्री धीरे क्योंकि बहुत ज्यादा आंदोलन अवांछनीय फोम के स्थायी गठन कारण होगा. झिल्ली गीला हालत में जोड़ा जाना चाहिए, संकरण बफर या यदि आवश्यक हो तो पानी में भिगोना और जोड़ने से पहले अतिरिक्त तरल निकास.
2. जांच प्रक्रिया
वॉशिंग झिल्ली
- पहले से गरम प्राथमिक धोने 60 डिग्री सेल्सियस के लिए बफर (माइक्रोवेव ओवन और / या हीटिंग प्लेट का उपयोग करें.)
- यदि वहाँ एक संकरण ट्यूब में 2 झिल्ली, एक साफ, preheated, खाली संकरण ट्यूब एक झिल्ली हस्तांतरण.
- संक्षेप में प्राथमिक धोने बफर के बारे में 50 मिलीलीटर के साथ संकरण ट्यूब कुल्ला.
- संकरण ट्यूब और 60 पर सेते ° सी 10 मिनट के लिए प्राथमिक धोने बफर के बारे में 100 मिलीलीटर जोड़ें.
- दोहराएँ 3 और 4 कदम.
- झिल्ली माध्यमिक धोने बफर के कम से कम 250 मिलीलीटर के साथ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कंटेनर और सेते धोने के लिए स्थानांतरण.
- चरण 6 दोहराएँ.
नोट: झिल्ली कमरे के तापमान पर माध्यमिक धोने बफर में रखा जा सकता है है, आधा घंटे के लिए संकेत पीढ़ी के पहले.
सिग्नल पीढ़ी और पहचान (प्रक्रिया के लिए एक झिल्ली)
- टेप tabletop पर दो SaranWrap फ्लैट के टुकड़े (और चरण 2 के लिए एक 4 कदम के लिए).
- ध्यान झिल्ली से बंद कंटेनर के पक्ष के खिलाफ झिल्ली के कोनों को छू द्वारा अतिरिक्त बफर और नाली SaranWrap (नमूना ऊपर की ओर) पर झिल्ली हस्तांतरण.
- और झिल्ली पर गुना सरन लपेटो झिल्ली पर ECF अभिकर्मक के 6-7 मिलीलीटर डालो. ध्यान से झिल्ली अधिक धीरे SaranWrap अधिक Kimwipe चलती ECF अभिकर्मक द्वारा वितरित. 5 मिनट के लिए सेते हैं.
- बंद झिल्ली से अधिक ECF अभिकर्मक नाली और यह नई SaranWrap, झिल्ली से अधिक गुना लपेटो, पर स्थानांतरण और टेप के साथ किनारों मुहर. कवर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ झिल्ली. 1-2 घंटे के लिए सेते हैं.
- गिलास प्लेट पर ECF अभिकर्मक के 1-2 मिली वितरण से स्कैनर गिलास प्लेट तैयार है. फिर गिलास प्लेट (नमूना नीचे की ओर) पर झिल्ली हस्तांतरण और झिल्ली पर एक और ECF अभिकर्मक के 1-2 मिलीलीटर वितरित. SaranWrap साथ ओवरले और ध्यान से सभी हवाई बुलबुले झिल्ली से दूर धक्का. (आप SaranWrap के शीर्ष पर एक कड़ी थाली कांच की थाली के खिलाफ दबाया झिल्ली रखने की जगह हो सकती है.)
- उत्तेजना 473 एनएम, पता लगाने फिल्टर LPB (510 एनएम), संकल्प 50 सुक्ष्ममापी, 16 - बिट संकेत स्नातक, CH1 400 (वी. स्कैन: फ़ूजी FLA 5100 निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ प्रतिदीप्ति ("1 लेजर एक छवि" मोड) स्कैनर का उपयोग करें 22 सेमी तक के बारे में 15-20 मिनट प्रति 22 आकार की झिल्ली लेता है.)
वैकल्पिक: - 2-4 घंटे (या अब) के लिए बैठते हैं हैं.
- दोहराएँ चरण 6 में के रूप में स्कैन.
3. विपठ्ठन और प्रक्रिया भंडारण (NUF संस्करण)
- 100% एट झिल्ली स्थानांतरणhanol और कोमल आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- ताजा इथेनॉल 100% के साथ बदलें और कमरे के तापमान पर रातोंरात सेते हैं. (झिल्ली इथेनॉल में कई दिनों के लिए रह सकते हैं.)
- आसुत जल के साथ इथेनॉल बदलें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- एसडीएस (अंतिम 0.5% एसडीएस) एक संकरण ट्यूब 100 मिलीलीटर पानी और 10% के 5 मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण धीरे. झिल्ली में जोड़ें.
- 80 में ° 1 एच. के लिए सी सेते
- एक स्वच्छ, खाली कंटेनर झिल्ली स्थानांतरण.
- 500 मिलीलीटर पानी और 10% एसडीएस के 5 मिलीलीटर (अंतिम एसडीएस 0.1%) एक बीकर और माइक्रोवेव ओवन में एक जोरदार फोड़ा करने के लिए गर्मी में जोड़ें.
- झिल्ली पर लगभग उबलते 0.1% एसडीएस समाधान डालो और धीरे से कई मिनट के लिए आंदोलन. कमरे के तापमान शांत करने के लिए अनुमति दें.
- कम से कम 10 मिनट के लिए बाँझ 100 मिमी Tris 8 पीएच के कम से कम 250 मिलीलीटर में कुल्ला.
- SaranWrap में लपेटें झिल्ली और टेप के साथ सावधानी करीब किनारों. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस (झिल्ली बाहर कभी नहीं सूखी चाहिए.)
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Discussion
विपठ्ठन प्रक्रिया अनुकूलित नहीं किया गया है. हालांकि, विपठ्ठन निर्माता के अनुदेश (2 प्रत्येक washes, 100% इथेनॉल में 10 मिनट, 60 एसडीएस डिग्री सेल्सियस 0.5% में 1 1 ज धोने) में दी गई प्रक्रिया अपर्याप्त है. कम से कम 100% इथेनॉल में रात भर ऊष्मायन ECF प्रतिक्रिया उत्पाद भंग करने के लिए आवश्यक है, 100% इथेनॉल में कई दिनों के ऊष्मायन झिल्ली reprobe की क्षमता पर कोई प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है प्रकट होता है. निर्माता एसडीएस इलाज भी करने के लिए अपर्याप्त प्रतीत होता है. NUF 80 से कम 1 घंटे की कोशिश की है डिग्री सेल्सियस 0.5% एसडीएस पास उबलते सफलता के साथ 0.1% एसडीएस के साथ एक इलाज के द्वारा पीछा के साथ. ट्रेसी ने दिखाया है कि एक समय - उबलते के पास 0.1% एसडीएस के साथ - पर डालने के लिये पर्याप्त है.
सहायक संकेत:
संकरण बफर, संकरण ट्यूब, और प्राथमिक धोने बफर से 60 preheated होना चाहिए ° सी से पहले का उपयोग करने के लिए, और है कि तापमान में प्रयोग भर रखा जाना चाहिए. एक हीटिंग Corning थाली में 60 के बारे में 3 परिणामों की एक सेटिंग डिग्री सेल्सियस पर, उदाहरण के लिए, एक डूबे थर्मामीटर के साथ एक गर्म थाली पर बफ़र्स रखने
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur | |||
| Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685 | ||||
