Summary
Gene-Funktion kann in loss-of-function Experimente verdeckt werden, wenn es eine Kompensation durch ein anderes Gen. Der Zebrafisch-Modell bietet eine relativ hohem Durchsatz, um eine solche funktionelle Redundanz in lebenden Embryonen zu offenbaren.
Abstract
Gene-Funktion während der Embryogenese wird typischerweise durch loss-of-function Experimente definiert, zum Beispiel durch gezielte Mutagenese (KO) in der Maus. In der Zebrafisch-Modell, über wirksame reverse genetische Techniken entwickelt, mit Mikroinjektion von Gen-spezifischen Antisense Morpholinos. Morpholinos Ziel einer mRNA durch spezifische Basenpaarung und Block Genfunktion vorübergehend durch die Hemmung der Translation oder Spleißen für mehrere Tage während der Embryogenese (Zuschlag). Doch bei Wirbeltieren wie Maus oder Zebrafisch, können einige Funktionen von Genen durch diese Ansätze durch die Anwesenheit eines anderen Gens, das für den Verlust entschädigt verdeckt werden. Dies gilt insbesondere für die Gen-Familien, die Schwester Gene, die in der gleichen entwickelnde Gewebe co-exprimiert. In Zebrafisch können funktionelle Kompensation in einem relativ hohen Durchsatz Weise getestet werden, durch Co-Injektion von Morpholinos dieses Ziel Knockdown von beiden Genen gleichzeitig. Ebenso mit Morpholinos, kann eine genetische Interaktion zwischen zwei Genen, die durch Knockdown beider Gene demonstriert zusammen mit sub-Schwellenwerte. Zum Beispiel kann Morpholinos titriert, so dass weder einzelne Knockdown einen Phänotyp erzeugt werden. Wenn unter diesen Bedingungen, Ursachen Co-Injektion von sowohl Morpholinos einem Phänotyp, ist eine genetische Interaktion gezeigt. Hier zeigen wir, wie man funktionale Redundanz im Rahmen von zwei verwandten GATA-Transkriptionsfaktoren zeigen. GATA Faktoren sind für die Spezifikation von kardialen Vorläuferzellen notwendig, aber dies ist nur durch den Verlust der beiden Gata5 und Gata6 enthüllt. Wir zeigen, wie die Durchführung Mikroinjektion Experimente bestätigen die Morpholinos, und bewerten die ausgeglichen Phänotyp für Kardiogenese.
Protocol
Unser Ziel ist es, die funktionelle Redundanz von zwei Transkriptionsfaktoren für die Spezifikation von Kardiomyozyten Vorfahren zu testen. Die Faktoren werden von den beiden Genen gata5 und gata6 kodiert, und wir sind mit dem Zebrafisch-Modell, um ihre relative Funktionen 1 zu verstehen. Unsere Strategie ist es Genfunktion mit Morpholinos 2 Block. Wir werden Morpholinos für die eine oder andere Gen in befruchtete Eier zu injizieren, und vergleichen Sie die embryonalen Phänotyp mit Embryonen aus Eizellen gleichzeitig mit beiden Morpholinos injiziert abgeleitet. Zur Vereinfachung der Auswertung der Phänotypen, verwenden wir Eier von Fischen stammen, die ein Transgen, dass GFP drückt in Kardiomyozyten zu tragen.
Schritt 1. Vorbereitung für die Mikroinjektion.
A) Einrichten Brutpaare von Fischen
Der Abend vor der Injektion, Einzel männlich und einzige weibliche adulte Fische (3-18 Monate alt) in Paaren in Züchterin Tanks durch einen Teiler bis zum nächsten Morgen getrennt platziert. Wir in der Regel eingerichtet 10-20 Paare von Fischen, und diese werden einmal pro Woche, gepaart unabhängig davon, ob die Eier verwendet werden, um die Fruchtbarkeit zu erhalten. Für dieses Experiment verwenden wir ein Reporter-Stamm, transgene für cmlc2: egfp, weil es eine einfache Anzeige auf differenzierende Kardiomyozyten zu identifizieren bietet. Am nächsten Morgen, wenn die Lichter eingeschaltet sind, wird das Wasser gewechselt eingeschaltet und Trennwände sind aus den Tanks ermöglicht den Fischen Paare sich zu paaren und Eier produzieren gezogen. Eierproduktion kann überwacht werden, und können sofort starten, oder nach einem Zeitraum von einer Stunde oder mehr, abhängig von den Fischen. In der Regel nach etwa 20 Minuten ununterbrochen Paarung werden die Eier gesammelt mit einer Pipette oder Sieb und gießt in 100 mm Petrischalen mit System Wasser. Es ist wichtig, Eierproduktion zu überwachen, um sicherzustellen, dass Embryonen zwischen die 1-4 Zell-Stadium injiziert werden. Durch die Freigabe mehrere Paare in einer Zeit, ist es möglich, die Eierproduktion staffeln können und damit die Menge der Eier, die in einem frühen Entwicklungsstadium eingespritzt werden kann. Ein gutes Paar Fisch kann mehr als 200 Embryonen, und es macht keinen praktischen Sinn, Tausende von Eiern zur gleichen Zeit zu sammeln, da ein einzelner Forscher nicht in der Lage wäre, sie schnell genug spritzen, bevor sie über die 4-Zellen-Stadium entwickelt . Fisch stimuliert werden, um das Licht-Zyklus zu züchten, so ist dies ein Experiment, das einen frühen Start erfordert, und Eier sind in der Regel nicht nach Mittag erhalten.
B) Vorbereitung Nadeln
- Verwenden Sie eine Mikropipette Puller und einem 3,5 "-Glaskapillare auf zwei Nadeln mit folgender Bedingung zu erzeugen: Wärme = 626, Pull = 60, Velocity = 60 und Time = 250 Wir nutzen Open-Core-Nadeln, die nicht enthalten ein Filament, da. wir Front-füllen sie mit Absaugung.
- Die Spitze der jede Nadel wird dann vorsichtig gebrochen mit einer Rasierklinge oder einer Pinzette und anschließend in einem 30 Grad Winkel für etwa 20 Sekunden abgeschrägt mit einer EG-4 Mikro-Mahlwerk. Das schärft die Spitze und ist wichtig, wenn Sie spritzen durch das Chorion.
- Es ist wichtig, um eine konsistente Nadeldurchmesser Spitze Größe von etwa 15 Mikrometer (kalibriert als 4 Einheiten mit einem gerasterten Mikroskop-Okular, in der Lage sein eine 1-2 nl Injektionsvolumen kalibrieren) zu erhalten.
- Needles sollte im Vorfeld vorbereitet werden, sicher an einem sicheren Ort gespeichert, und jeder wird einzeln kurz vor Beginn Injektionen, um konsistente Injektionsvolumen versichern (siehe Abschnitt D für weitere Details) kalibriert. Wenn Sie Glück haben, können Sie möglicherweise auf eine einzige Nadel für eine ganze Experiment verwenden. Allerdings kann eine Nadel leicht in der Mitte eines Experiments zu brechen, und Sie wollen nicht, dass Zeit nutzen, um neue Nadeln zu ziehen.
C) Die Injektion Platten
- Es werden 100 ml einer 2% igen Lösung in Wasser-System, durch das Kochen in der Mikrowelle.
- Kühl an, und gießen Sie etwa 12ml in die umgedrehte Deckel eines 100mm Petrischale.
- Legen Sie 2 Objektträger, bei ca. 45-Grad-Winkel schräg in die beiden Seiten des Deckels. Nachdem die Agarose erstarrt ist, ziehen Sie die beiden Schieber vom Deckel.
- Dies schafft Tröge, wo Embryonen platziert und anschließend injiziert wird. Mehrere Platten können im Voraus vorbereitet werden. Sie können auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C gelagert werden nach dem Hinzufügen einer Schicht aus 70% Ethanol, das Hinzufügen der Unterseite der ursprünglichen Platte und Abdichtung mit Parafilm. Denken Sie daran, gut waschen, bevor Sie.
D) Mikroinjektion Station und Nadel-Kalibrierung
- Schalten Sie das komprimierte Stickstoffquelle und PLI-100 Mikroinjektor. Der Injektor sollte für einen konstanten Druck von 18 PSI eingestellt werden.
- Vor dem Einsetzen einer Nadel, sicherzustellen, dass die Mikromanipulator in eine geeignete Position, um eine breite Palette von Bewegung zu ermöglichen, und dass eine eingelegte Nadel wird nicht schlagen den Tisch. Legen Sie eine derdie Nadeln zuvor (siehe Abschnitt C) in den Mikromanipulator sicherstellen, dass es eine gute Abdichtung vorbereitet. Achten Sie darauf, um die Nadel zu brechen.
- Beachten Sie die Nadelspitze unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, ist es nicht, bevor Sie fortfahren, um die Kalibrierung verstopft.
- Geben Sie einen Tropfen (2-3 ul) Injektionslösung oder ddH 2 O auf ein kleines Stück Parafilm und füllen etwa 1,5 ul, indem Sie sie in die Nadel mit dem zu füllen Taste. Seien Sie sicher, dass Sie die Nadelspitze voll in die Lösung haben, und beobachten Sie die Flüssigkeit Sog durch das Mikroskop zu zeichnen in die Luftblasen zu vermeiden.
- Geben Sie einen Tropfen Mineralöl auf das Gitter von einem Mikrometer.
- Passen empirisch zum Zeitpunkt der Injektion, um sicherzustellen, dass die Tropfengröße ca. 1,5 Mikrometer im Durchmesser ist. Dies sorgt für ein Injektionsvolumen von etwa 1,8 nl. Das tatsächliche Volumen kann um Ihre Wahl eingestellt werden, sondern in einem praktischen Sinne ist es schwierig, genau zu kalibrieren Volumina unter 1 nl, und die Embryonen dürfen nicht dulden Mengen von mehr als 2 nl. Unabhängig von der Volume-Größe Sie sich entscheiden, halten es die gleiche für alle Injektionen einschließlich Kontrollen, und passen Sie Ihre Lösung Konzentrationen (anstelle der Einspritzmenge), um die Menge des eingespritzten Morpholino titrieren.
- Neukalibrierung erforderlich ist jedes Mal eine Nadel ersetzt, da die Nadelspitze Größen variieren.
Schritt 2. Validierung von Morpholinos Targeting zwei verschiedene Gene
Morpholinos sind entworfen, um die Übersetzung Initiationsstelle oder Spleißstellen einer Ziel-mRNA und blockiert die Proteinsynthese oder die ordnungsgemäße Verarbeitung mRNA Ziel. Bei der Analyse eines Gens zum ersten Mal benutzen wir beide Arten von Morpholinos zu testen, ob sie den gleichen Phänotyp erzeugen Angabe einer bestimmten Zuschlag. Ein Vorteil der Spleiß-Blocker ist, dass man den Zuschlag für die normale Transkript mittels RT-PCR, was besonders nützlich ist, wenn Antikörper für das Ziel-Gen nicht zur Verfügung stehen zu überprüfen. Wir werden zeigen, wie eine konsequente kardialen Phänotyp für die gata5 und gata6 Gene mit Morpholinos (gata5 5'UTR MO-Sequenz ist erreicht: 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3 '; gata5 Splice-Site MO Sequenz: 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'; gata6 5 'UTR MO Sequenz: 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3').
- Morpholinos sind von Gene Tools, LLC (Philomath, OR) erhalten. Gene-Tools hilft Ihnen dabei, die beste Folge zum Ziel, wenn Sie ihre Support-Mitarbeiter fragen. Sie müssen nur senden sie die Zugangsnummer, und sie beraten. Es gibt jedoch keine Garantie, dass der Morpholino funktioniert, weshalb man darauf vorbereitet sein, die Aktivität zu validieren müssen. Sie können auch überprüfen, ob die Morpholino ist ab OpenBiosystems. Gene Tools bietet Bestände synthetisiert Morpholinos zu OpenBiosystems. Zwar gibt es wieder keine Garantie dafür, es wird funktionieren, verkaufen sie kleinere Mengen zu niedrigeren Kosten, die möglicherweise zu decken Kosten für die Erprobung neuer Ziele zu helfen. Achten Sie darauf, Ihre Morpholino gegen die Transkriptom-BLAST, verwenden wir die BLAT Feature auf der UCSC Zebrafisch-Genom-Browser (genome.ucsc.edu). Natürlich, wenn eine Morpholino validiert worden ist (streng) in der Literatur, ist es empfehlenswert, dass Sie die gleiche Sequenz zu erwerben.
- Der Morpholino wird in sterilen ddH 2 0 bis zu einer Endkonzentration von 1 mM gelöst und bei Raumtemperatur gelagert. Nicht einfrieren Morpholino-Lösungen, als aus irgendeinem Grund niedrigen Temperaturen manchmal dazu führen, können sie zu aggregieren und ausfallen. Morpholinos sind unempfindlich gegen Proteasen oder Nukleasen, so lange, wie das Wasser fügen Sie steril ist, sollten sie ganz sicher bei Raumtemperatur.
- Vor der Injektion, Inkubation der Morpholino bei 65 ° C für 5 Minuten, um es zu sichern vollständig gelöst ist, und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen. Sie NICHT in die Probe auf Eis. Halten Sie die Morpholino bei Raumtemperatur bis zur Injektion.
- Um titrieren eine Morpholino wir in der Regel bereiten serielle Verdünnungen der Lager-Konzentration in ddH 2 0 zu arbeiten Konzentrationen von 1 mM Ertrag, 0,5 mm, 0,25 mm und 0,125 mm. Je nach der Reihenfolge, mit 1,8 nl der Einspritzmenge, bedeutet dies etwa 20ng, 10ng, 5NG und 2.5ng der Morpholino pro Injektion. Dies ist nur ein Ausgangspunkt, da die Verträglichkeit und Wirksamkeit der einzelnen Morpholino variieren und kann nicht vorhergesagt werden. Die meisten Morpholinos wird nicht viel über 20 ng toleriert werden, aber einige können wirksam in Dosen deutlich unter 1 ng. Unser Ansatz ist es, die Konzentration, bei der ein Phänotyp "Plateaus" zu definieren. In anderen Worten, wenn eine definierte Phänotyp nicht gesehen wird mit 2,5 ng, ist aber ähnlich mit einem beliebigen Betrag auf oder über 5 ng, würden wir wählen 5 ng als Schwellenwert. Natürlich kann es sinnvoll sein, neben titrieren zwischen 2,5 ng und 5,0 ng, um sicherzustellen, dass Sie sich reproduzierbar über die Schwelle arbeiten, anstatt richtig "an der Grenze".
- Füllen Sie das beigefügte und kalibriert Nadel(Siehe oben) mit der niedrigsten Konzentration arbeiten (die meisten verdünnten) Morpholino Lösung. Vermeiden Sie zu füllen die Nadel, da es einfach wird Abfallmaterial. Wenn Sie nur 1 ul zu füllen, gibt es ausreichende Lösung für 500 Injektionen.
- Mit einem Einweg-Pipette befruchtet one-Embryonen in die Mulden der Mikroinjektion Platte. Überschüssiges Wasser, um sicherzustellen, dass die Embryonen in die Unterseite der Injektion Tröge fallen. Sie sollten nicht schwimmen, sondern um die Agarose Bett zu halten.
- Position der Injektion Platte, so dass die Mikromanipulator der Nadelspitze durch das Chorion und in den Dotter zur Injektion steigen kann. Zur Positionierung einzelner Embryonen, manipulieren die Injektion Platte, so dass die Spitze der Injektionsnadel oder schiebt zieht die Embryonen in die richtige Position. Achten Sie darauf, nicht auf die Nadelspitze oder Schäden Embryonen zu brechen! Dies erfordert einige Übung, aber in der Regel verwenden Sie die Mikromanipulator einfach auf die Injektionsnadel in den Embryo zu bewegen und dann nach der Injektion, sondern schnell und sauber aus. Die Embryonen werden in die Injektionsstelle, indem Sie die Platte mit der freien Hand (linke Hand, wenn Sie spritzen mit der rechten Hand) gebracht. Für einen neuen Lernenden, ist es sinnvoll, die Praxis mit einer Lösung mit 0,25% Phenolrot, um die injizierte Lösung zu visualisieren. , Um diese Lösung zu bestätigen war in den Embryo injiziert wird, anstatt die inter-Chorion Raum.; Vertrauen ist auch durch die Injektion einer Lösung mit Fluoreszenz-markierten Mikrosphären (F-8794 Molecular Probes) erworben Doch nach ein paar Runden der Praxis sind diese Hilfen in der Regel nicht mehr erforderlich. Es ist eine gute Idee, gelegentlich in die Luft spritzen, nur um zu bestätigen, dass die Nadel nicht verstopft ist und dass das Volumen der Injektion erscheint angemessen.
- Injizierten Embryonen werden wieder zu einem 100mm Petrischale mit System Wasser überführt und kultiviert bei 28.5C. Nach Injektion der niedrigsten Arbeitskonzentration kann jeder verbleibende Lösung vertrieben werden und die nächst höhere Arbeitskonzentration von Morpholino verwendet werden, um die Nadel zu füllen. Wiederholen Sie für jede Konzentration der Morpholino. Obwohl es möglich ist, spülen Sie die Nadel mit Wasser, bei der Prüfung eine deutliche Morpholino, ziehen wir es vor Nadeln zu ändern und neu zu kalibrieren. Achten Sie darauf, eine Kohorte von injizierten Embryonen zu überprüfen, ob mit der betreffenden Charge von Embryonen gesund und normal war zu halten.
Schritt 3. Co-Injektion von Morpholinos an einzelnen Schwellendosen
Das Ziel der Titration oben ausgeführt wurde, um eine Schwellendosis für jeden Morpholino definieren. Im besten Fall wird im wesentlichen 100% der morphants Anzeige eines definierten Phänotyp, wenn die gezielte Gen hat eine wesentliche Funktion. Sie können jedoch erwarten, dass einige Variabilität durch falsche Injektion Artefakte. Mit etwas Übung sollte dies nicht mehr als 10%. Einige Chargen von Embryonen (einschließlich der injizierten Kontrollen) kann nicht gut überleben, in welchem Fall das Experiment Möglicherweise müssen abgezinst werden. Inzwischen gibt es auch biologische Variabilität, da die einzelnen Embryonen können mehr oder weniger tolerant gegenüber den Zuschlag. Schließlich können einige Morpholinos einfach nicht effizient genug, um eine robuste (penetrant) Knockdown erreichen. Wenn ein Phänotyp in einem geringen Prozentsatz von Embryonen erzeugt wird, aber reproduzierbar ist, kann es sich lohnen, Tests eine deutliche Morpholino. Das Ziel dieser nächsten Experiments ist es, festzustellen, ob ein völlig neues Erscheinungsbild zeigt sich, wenn beide Gene gleichzeitig ausgerichtet sind. Wir sind nicht einfach auf der Suche nach einer Erhöhung des Anteils von Embryonen, die eine morphant Phänotyp haben, sondern vielmehr für die Erzeugung von einer deutlichen Phänotyp, die nicht auf oder über dem Schwellenwert gesehen wird bei der Prüfung entweder der einzelnen Gene.
- Bereiten Sie eine Mischung aus der Kombination von Morpholinos zuvor, an der Schwelle Konzentration jedes einzelnen Morpholino, die einen definierten Phänotyp generiert getestet. Zum Beispiel, wenn der Schwellenwert für jedes Gen 5 ng wurde, bereiten eine funktionierende Lösung, die 5 ng + 5 ng von jedem (10 ng Gesamt-) enthalten wird. Da Embryonen nicht tolerieren kann viel mehr als 20 ng Gesamt-Morpholino, ist es wichtig, auf der Grundlage der früheren Experimenten, um die minimale Menge von jedem die ausreicht, um effizient Ziel jedes Gen zu verwenden.
- Kontrollen sollten Folgendes umfassen Sätze von Embryonen mit jedem einzelnen Morpholino allein in der gleichen Konzentration, die für die Kombination injiziert wurde. Volumes Injektionslösung sollte konstant gehalten werden (z. B. 1,8 nl). Ein großer Vorteil der Verwendung eines Reporters Belastung ist, dass man den Phänotyp (zB Kardiomyozyten Differenzierung) zu jeder Zeit zu bewerten, und immer wieder. Wenn Embryonen für die Genexpression durch in situ Hybridisierung ausgewertet werden, kann Phase abgestimmte Embryonen und Kontrollen zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion fixiert werden. Für unser Experiment, werden wir die GFP-Expression als Surrogat für Kardiomyozyten Differenzierung zu bewerten, mit rund 24 hpf.
Schritt 4. EBewertung von Phänotypen
- Injizierten Embryonen sollte überwacht werden, kurz nach der Injektion, und mehrere Male während des Tages, an jedem toten oder sterbenden Embryonen zu entfernen, da diese die Rentabilität der übrigen morphants kompromittieren können. Zur Beurteilung Expression des Reporter-Gen, sind Embryonen untersucht mit einem Binokular mit Fluoreszenz-Kapazität ausgestattet. Wir verwenden eine Nikon SMZ1500 Mikroskop, mit einem 1X oder 1,6 x Objektiv und eine Reihe von Vergrößerung von 0,75 x auf 11.25x. Bei Verwendung eines fluoreszierenden Filter, achten Sie darauf, das Zwerchfell in die vollständig geöffnete Einstellung zu öffnen, um die Lichtintensität zu maximieren. Auch sicher sein, den richtigen Filter zu verwenden, abhängig von der Reporter-Gen (GFP, RFP, etc.).
- Embryonen sind in der Regel sediert mit einem 1 / 20 Verdünnung im System Wasser 4mg/ml Bestand Tricaine Methansulfonat. Die Aktien werden in gefrorenem Zustand bei-20C. Alternativ können Embryonen getötet mit dem 20x Tricaine Lager sein. Embryonen können in der Regel abgeschirmt, auch wenn sie noch in der Chorion sind. Doch gerade, wenn sie fotografiert werden, ist es eine gute Idee, die Chorion mit scharfen Pinzette entfernen. Embryonen können nach dem Platzieren in Depression rutscht in die Tricaine Lösung, oder besser immobilisieren für die Fotografie zu einem kleinen Rückgang von 3% Methylcellulose gestellt betrachtet werden.
- Beachten Embryo Phänotypen in denen mit der Kombination von Morpholinos im Vergleich zu Single morphants injiziert. Hier sind wir für das Muster der GFP-Expression in den ursprünglichen Herzschlauches suchen. In dieser Reporter-Stamm GFP ist ausschließlich in Kardiomyozyten über die cmlc2 Promotor, die eine detaillierte Analyse der kardialen Spezifikation und Herzschlauches Morphogenese ermöglicht ausgedrückt.
Repräsentative Ergebnisse
In unserem Experiment zeigen sowohl die gata5 und gata6 einzigen morphants reproduzierbare kardialen Phänotypen, wenn sie mit Schwellenwerten injiziert, obwohl es erhebliche biologische Variabilität 3,4. Zum Beispiel erzeugen die meisten der gata5 morphants ein bifid Herzen, mit GFP-Expression in zwei Regionen. Dies geschieht, weil der kardialen Vorläuferzellen migrieren nicht korrekt auf der Mittellinie im Herzen tube formation Sicherung. Allerdings haben einige der gata5 morphants erzeugen ein defektes Herz Röhre, und in eine kleine Anzahl (5%) gibt es einen deutlichen Rückgang in Höhe von GFP +-Zellen. Wir glauben, dies spiegelt biologischen Variabilität, kann aber auch aufgrund der Tatsache, dass Morpholinos nicht gleichbedeutend mit einer "Null"-Mutation.
Auch die gata6 morphants alle zeigen eine kardiale Phänotyp, aber es gibt eine Reihe von Phänotypen mit einer kleinen Anzahl von bifid erwärmt, und Herzen, die morphologische sind die injizierten Embryonen Kontrolle gestört verglichen. Diese Variabilität ist nicht für eine kardiale morphogenetic Phänotyp ungewöhnlich, da Herz-Bildung ist ein dynamischer Prozess und zumindest einige der Herz-Phänotyp kann durch indirekt aus embryonalen morphogenetischen Defekten. Doch wichtiger ist, ist der Bereich der kardialen morphogenetic Mängel für beide gata5 und gata6 morphants konsistente und reproduzierbare und zum größten Teil die Embryonen erzeugen erhebliche GFP + Kardiomyozyten.
In krassem Gegensatz zu den gata5 und gata6 einzigen morphants zeigen Embryonen beider Faktoren aufgebraucht einem vollständigen Verlust der GFP-Expression, im Einklang mit einem Verlust von Herzmuskelzellen. So haben gata5 und gata6 jeder nicht-redundante Funktionen zur kardialen Morphogenese, aber die beiden Gene sind funktionell redundant in eine Voraussetzung für die Erzeugung von differenzierten Kardiomyozyten. Unsere früheren Studien zeigten auch einen Verlust der frühesten Kardiomyozyten Marker, einschließlich Nkx2.5, was auf eine Anforderung für Kardiomyozyten Spezifikation 3.
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Discussion
In dem hier beschriebenen Experiment, kombiniert man zwei Morpholinos, von denen jeder allein erzeugen eine deutliche Reihe von Phänotypen, und fand eine ganz andere Phänotyp, wenn sie co-injiziert zusammen. Natürlich benötigten wir eine Rechtfertigung dafür dieses Experiment in den ersten Platz. Wir vermuteten, dass die beiden Gene könnten sich gegenseitig für eine frühere Funktion zu kompensieren, in diesem Fall kardiale Spezifikation. Dies liegt daran, die Gene sehr verwandt sind (und in der Lage die Bindung an den gleichen DNA-Sequenzen) und sind in überlappenden Mustern während der Embryogenese 5 ausgedrückt. Darüber hinaus gaben genetische Experimente in Drosophila, dass GATA-Transkriptionsfaktoren sollten für die Herz-Spezifikation 6 erforderlich sein.
Allerdings gibt es andere Situationen, die diese Strategie für das Testen funktionelle Redundanz oder allgemein für genetische Interaktionen genutzt werden könnten. Erstens könnte Knockdown von einem oder beiden Genen erzeugt keine offensichtlichen Phänotyp. In diesem Fall gibt es keine definierten Schwellenwert für jedes Gen, und die Menge der Morpholino zu nutzen wird empirisch festgelegt werden, begrenzt durch, wie gut sie von den Embryonen vertragen. Auch hier wird die Begründung für die Prüfung Entschädigung wahrscheinlich, dass die Gene sehr verwandt sind und von der Bestätigung Co-Expressionsmuster. Zweitens genetischen Wechselwirkungen können für ein beliebiges Gen-Paar mit Sub-Threshold-Mengen Morpholinos getestet werden. In dieser Strategie ist die maximale Menge, die nicht erzeugt einen Phänotyp für jeden Morpholino verwendet. Wenn die Kombination beider Morpholinos erzeugt einen Phänotyp, bietet diese stichhaltigen Beweise für eine genetische Interaktion, obwohl es vielleicht ganz indirekte oder sogar stellen parallele Wege. Drittens Co-Injektion von einem zweiten Morpholino können Rettungs den Phänotyp der ersten, wenn die beiden Gene in einer antagonistischen Weise (was wiederum kann indirekt) zu interagieren. Zwar gibt es keine definierte Grenze, wie viele verschiedene Gene gezielt werden kann, in einem praktischen Sinne ist es wohl 3-4 Genen, abhängig von der Höhe des jeweiligen Morpholino, dass bei einer Schwelle Reaktion benötigt wird.
Während dieser allgemeinen Ansatz der Verwendung der reversen Genetik, neue Genfunktionen offenbaren relativ hohem Durchsatz, gibt es eine Reihe von Vorbehalten zu erwägen über Morpholinos. Bevor die Kombination Morpholinos, sind beträchtliche Anstrengungen erforderlich, um einzelne Reagenzien zu validieren, sofern dies nicht bereits getan. Jede einzelne Morpholino kann nicht funktionieren, während andere erzeugen kann off-targeting "Artefakt" Phänotypen besonders mit der Aktivierung der weit verbreiteten Apoptose assoziiert. Die Reagenzien sind nicht billig, und wenn zwei oder mehr Morpholinos erforderlich sind, um jedes Gen zu validieren, diese Investition können erheblich sein.
Mehrere Überlegungen leiten die experimentelle Strategie.
i) Gibt es eine bekannte Mutantenphänotyps? Wenn ja, sollte ein einzelner Phäno-Kopieren Morpholino ausreichend sein.
ii) Gibt es einen Antikörper zur Verfügung? Wenn ja, können eine Übersetzung-Blocker bevorzugt werden, und wenn nicht, wird es wichtig sein zu dokumentieren, dass ein Spleiß-Blocker effektiv Ziele der prä-mRNA.
iii) Können Sie retten die morphant durch Injektion von mRNA? Wenn dies funktioniert, bietet es hervorragende Beweise für Morpholino Spezifität. Allerdings kann es oft nicht, durch falsche Ausrichtung der injizierten mRNA. Rettung könnte auch getestet Transposon-basierten Transgenese werden, da dies engere räumliche und zeitliche Kontrolle über Ausdruck der gezielten Gen ermöglichen kann. In jedem Fall ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Rettung Gen nicht durch den Morpholino ausgerichtet.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Mitglieder der Evans-Labor für ihre Hilfe bei der Vorbereitung dieser Präsentation. Die hier verwendeten Morpholinos wurden ursprünglich von Dr. Audrey Holtzinger validiert. TE wird durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (HL064282 und HL056182) unterstützt. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch das Institute for Animal Care und Verwenden eingesetzten Ausschusses, des Weill Cornell Medical College durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | ||
| Fish nets | Aquatic Habitats | ||
| System water | 60mg Instant Ocean” per liter dH2O | ||
| 100mm Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| Micropipette needle puller | Sutter Instrument Co. | P-97 Flaming/Brown | |
| 3.5" glass capillaries | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Razor blade | Personna Medical Care | 94-120-71 | |
| Micro grinder | Narishige International | EG-4 | |
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | |
| Micrometer | WARD’s Natural Science | 94 W 9910 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | |
| Disposable weigh dishes | Fisher Scientific | 2-202-B | |
| Conventional microwave | GE Healthcare | ||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552 | |
| Graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6D | |
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | |
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | |
| N2 tank | Tech Air | ||
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Parafilm | American National Can | PM-992 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’ | |
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’ | |
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’ | |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Labs | MS-222 | |
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | |
| Heat Block | Fisher Scientific | 11-718-4 | |
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | |
| Depression Microslides | VWR international | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
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