Summary
פונקציה ג'ין יכול להיות מוסתר על הפסד של פונקציה ניסויים אם קיים פיצוי על ידי גן אחר. המודל של דג הזברה מספק תפוקה גבוהה יחסית אמצעי לחשוף יתירות פונקציונלית כאלה עוברים חיים.
Abstract
פונקציה ג'ין במהלך embryogenesis מוגדר בדרך כלל על ידי אובדן של פונקציה ניסויים, למשל על ידי mutagenesis ממוקד (נוקאאוט) בתוך העכבר. במודל דג הזברה, יעיל טכניקות גנטיות הפוך פותחו באמצעות microinjection של גן ספציפי morpholinos antisense. Morpholinos יעד mRNA באמצעות זיווג בסיסים ספציפיים גן פונקציה לחסום זמנית על ידי תרגום שחבור עיכוב או במשך מספר ימים במהלך embryogenesis (מציאה). עם זאת, בעלי חוליות כמו עכבר או דג הזברה, פונקציות כמה גנים יכולים להיות מוסתר על ידי גישות אלו בשל נוכחותם של גן אחר אשר מפצה על אובדן. זה נכון במיוחד עבור משפחות גנים המכילים גנים אחותו כי הם שיתוף לידי ביטוי בפיתוח רקמות זהה. בשנת דג הזברה, פיצוי תפקודית ניתן לבדוק באופן יחסית תפוקה גבוהה, על ידי הזרקה משותף של morpholinos כי היעד מציאה של שני גנים בעת ובעונה אחת. כמו כן, באמצעות morpholinos, אינטראקציה גנטית בין כל שני גנים ניתן להדגים על ידי מציאה של גנים שניהם יחד משנה סף רמות. לדוגמה, ניתן morpholinos טיטרציה כזו לא מציאה הפרט יוצר פנוטיפ. אם, בתנאים אלה, שיתוף הזרקה של שני morpholinos גורם פנוטיפ, אינטראקציה גנטית מוצג. כאן אנו מדגימים כיצד להראות יתירות פונקציונלית בהקשר של שני גורמי תעתוק הקשורות גאטה. גורמים gata חיוניים מפרט של אבות לב, אבל זה מתגלה רק על ידי אובדן של שני Gata5 ו Gata6. אנו מראים כיצד לבצע ניסויים microinjection, לאמת את morpholinos, ולהעריך את הפנוטיפ פיצוי cardiogenesis.
Protocol
המטרה שלנו כאן היא לבחון את יתירות פונקציונלית של שני גורמי שעתוק עבור המפרט של אבות cardiomyocyte. גורמים מקודדים על ידי שני גנים הקשורים gata5 ו gata6 ואנחנו באמצעות מודל דג הזברה כדי להבין פונקציות היחסי 1. האסטרטגיה שלנו היא לחסום לתפקד הגן באמצעות morpholinos 2. אנו מזריקים morpholinos אחד או הגן אחרים לתוך ביציות מופרות, ולהשוות את הפנוטיפ עובריים שמקורם בעוברים עם ביצים מוזרק במקביל morpholinos שניהם. כדי לפשט את ההערכה של פנוטיפים, אנו משתמשים ביצים שמקורם מדגים כי לשאת transgene המבטא GFP ב cardiomyocytes.
שלב 1. הכנה microinjection.
א) הגדרת זוגות הרבייה של דגים
הערב לפני הזריקה, דגים יחיד זכר בוגר יחיד נקבה (3-18 חודשים של גיל) מוצבים בזוגות לתוך טנקים מגדל מופרדים על ידי מחיצה עד למחרת בבוקר. אנחנו בדרך כלל להקים 10-20 זוגות של דגים אלה הזדווגו פעם בשבוע, לא משנה אם את הביצים ישמש, כדי לשמור על הפוריות. לצורך ניסוי זה אנו משתמשים זן הכתב, מהונדס עבור cmlc2: egfp, מכיוון שהוא מספק readout פשוט לזהות cardiomyocytes מבדל. למחרת בבוקר, ברגע שהאורות נדלקים, המים השתנה, חוצצים נמשכים מטנקים המאפשר זוגות דגים להזדווג לייצר ביציות. ייצור ביצה יכול להיות פיקוח, ועלול ליזום מיד, או לאחר פרק זמן של שעה או יותר, תלוי הדגים. בדרך כלל, לאחר כ 20 דקות של הזדווגות ללא הפרעה, ביצים נאספים בעזרת פיפטה או מסננת ושפך לתוך 100 מ"מ צלחות פטרי המכילות מים במערכת. חשוב לפקח על ייצור ביצים על מנת להבטיח כי עוברי מוזרקים בין שלב 1-4 התא. על ידי שחרור כמה זוגות בכל פעם, אפשר להתנודד הייצור ביצה, ובכך למקסם את כמות הביצים כי ניתן להזריק בשלב התפתחותי מוקדם. זוג טוב של דגים עלול ליצור יותר מ -200 עוברים, וזה לא הגיוני מעשי לאסוף אלפי ביצים באותו זמן, שכן חוקר אחד לא יוכל להזרים אותם מספיק מהר לפני שהם מפתחים מעבר לשלב 4 תאים . דגים הם גירוי להתרבות על מחזור אור, אז זה ניסוי הדורש להתחיל מוקדם, ביצים לא מתקבלים בדרך כלל אחרי הצהריים.
ב) הכנת מחטים
- השתמש פולר micropipette ו 3.5 "שפופרת זכוכית נימי ליצור שתי מחטים באמצעות התנאי הבא: מחממים = 626, משוך = 60, מהירות = 60, ושעה = 250 אנו משתמשים במחטים הליבה לפתוח שאינן מכילות חוט להט, כי. אנו הקדמי למלא אותם עם יניקה.
- קצה המחט כל כך שבור בעדינות באמצעות סכין גילוח נקי או מלקחיים, לבין משופעים לאחר מכן ב 30 מעלות בזווית של כ 20 שניות באמצעות מטחנת מיקרו EG-4. זה מחדד את טיפ חשוב אם אתה להזריק דרך סיסית.
- חשוב לקבל עקבי מחט בקוטר טיפ בגודל של מיקרון על 15 (מכויל כמו 4 יחידות באמצעות מיקרוסקופ העינית gridded, כדי להיות מסוגל לכייל נפח הזרקה 1-2 nl).
- מחטים צריכים להיות מוכנים מראש, מאוחסנים בבטחה במקום בטוח, וכל אחד מהם הוא מכויל בנפרד רק לפני תחילת זריקות כדי להבטיח נפח הזרקה עקבית (ראה סעיף ד 'לפרטים נוספים). אם אתה בר מזל, ייתכן שתוכל להשתמש במחט יחיד עבור ניסוי כולו. עם זאת, מחט יכול בקלות לשבור באמצע ניסוי, אתה לא רוצה להשתמש בו כדי למשוך זמן מחטים חדשים.
ג) ביצוע צלחות הזרקה
- הכן 100 מ"ל של פתרון agarose 2% מים מערכת, על ידי הרתחה במיקרוגל.
- מגניב למגע, ויוצקים על 12ml לתוך המכסה הפוכה של צלחת פטרי 100mm.
- הכנס 2 שקופיות מיקרוסקופ, מלוכסנות על כ 45 מעלות, אל שני הצדדים של המכסה. לאחר agarose יש הקרושה, משוך בעדינות את שתי שקופיות מן המכסה.
- זה יוצר שקתות שבו עוברים יוצב והזריקו לאחר מכן. הצלחות מרובות ניתן להכין מראש. הם יכולים להיות מאוחסנים ללא הגבלת זמן לאחר הוספת שכבה של אתנול 70% ב 4 ° C, והוסיף את החלק התחתון של צלחת המקורי, איטום עם parafilm. זכור לשטוף היטב לפני השימוש.
ד) Microinjection תחנת וכיול מחט
- הפעל את מקור חנקן דחוס PLI-100 microinjector. ההזרקה צריך להיות מותאם הלחץ זרם קבוע של 18 PSI.
- לפני החדרת מחט, להבטיח כי micromanipulator נמצא במצב תקין כדי לאפשר מגוון רחב של תנועה, וכי מחט מוכנס לא יכה את הטבלה. הכנס אחדמחטים שהוכן קודם לכן (ראה סעיף ג) לתוך micromanipulator לוודא שיש חותם חזק. היזהר שלא לשבור את המחט.
- שים את קצה מחט תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהוא לא סתום לפני שתמשיך כיול.
- המקום טיפה (2-3 μl) של פתרון הזרקה או DDH 2 O על חתיכה קטנה של parafilm ולמלא כ -1.5 μl ידי משיכת אותו לתוך המחט באמצעות לחצן למלא. ודא שיש לך את קצה המחט באופן מלא את הפתרון, ולבחון את היניקה נוזל מבעד למיקרוסקופ, כדי למנוע כל ציור בועות אוויר.
- מקום טיפה של שמן מינרלי על הרשת של מיקרומטר.
- התאם באופן אמפירי את זמן ההזרקה כדי לוודא את גודל הירידה הוא כ 1.5 מיקרון קוטר. זה יספק נפח הזרקה של ~ 1.8 nl. היקף בפועל ניתן להתאים את הבחירה שלכם, אבל מבחינה מעשית קשה במדויק לכייל כרכים להלן 1 nl, ועוברים לא יכול לסבול כרכים מעל 2 nl. ללא קשר לגודל נפח תבחר, לשמור את זה זהה עבור כל הזריקות שלך כולל בקרות, ולהתאים ריכוזי הפתרון שלך (ולא נפח הזרקה) כדי לכיל את כמות morpholino מוזרק.
- Recalibration הכרחי בכל פעם מחט מוחלף, מאז קצה המחט הגדלים ישתנו.
שלב 2. אימות של morpholinos מיקוד שני גנים שונים
Morpholinos נועדו למטרה חניכה תרגום האתר או באתרים אחוי של mRNA יעד ובכך חוסם סינתזת החלבון או עיבוד mRNA תקין. כאשר מנתחים את הגן בפעם הראשונה, אנחנו משתמשים בשני סוגים של morpholinos כדי לבדוק אם הם מייצרים את אותו הפנוטיפ, מה שמעיד על מציאה ספציפיים. היתרון של חוסם-אחוי היא שאתה יכול לאמת את מציאה של תמליל נורמלי על ידי RT-PCR, אשר הוא שימושי במיוחד אם יש נוגדנים עבור הגן היעד אינם זמינים. נדגים כיצד פנוטיפ לב עקבי מושגת עבור gata5 ו gata6 גנים באמצעות morpholinos (gata5 5'UTR רצף MO: 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3 "; gata5 האתר אחוי רצף MO: 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3"; gata6 5 'UTR רצף MO: 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3 ").
- Morpholinos מתקבלים ג'ין כלים, LLC (Philomath, OR). כלים ג'ין יעזור לכם לבחור את הרצף הטוב ביותר היעד, אם תשאל צוות התמיכה שלהם. אתה רק צריך לשלוח להם את המספר ההצטרפות, והם ימליצו. עם זאת, אין ערובה כי morpholino יפעל, וזה למה אתה צריך להיות מוכן כדי לאמת את הפעילות. אתה יכול גם לבדוק אם morpholino זמין OpenBiosystems. כלים ג'ין מספקת של מניות morpholinos מסונתז אל OpenBiosystems. אמנם יש עוד כל ערובה שזה יעבוד, הם מוכרים כמויות קטנות יותר במחיר נמוך יותר, אשר עשוי לסייע עלויות לשלם עבור בדיקות מטרות חדשות. הקפד תפציץ morpholino שלך נגד transcriptome, אנחנו להשתמש בתכונת בלאט על דג הזברה דפדפן הגנום UCSC (genome.ucsc.edu). כמובן, אם morpholino יאומת (בקפידה) בספרות, זה מומלץ לרכוש את אותו רצף.
- Morpholino הוא מומס DDH סטרילי 2 0 עד ריכוז סופי של 1 מ"מ ו מאוחסן בטמפרטורת החדר. אל תעשו FREEZE הפתרונות morpholino, כמו מסיבה כלשהי בטמפרטורות נמוכות יכולה לפעמים לגרום להם המצרפי המשקע. Morpholinos אינם רגישים או פרוטאזות nucleases, כל עוד אתה מוסיף את המים היא סטרילית, הם צריכים להיות די בטוחים בטמפרטורת החדר.
- לפני הזרקה, דגירה morpholino ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להבטיח שהוא נמס לגמרי, ולאפשר להתקרר לטמפרטורת החדר. אין למקם את המדגם על הקרח. שמור את morpholino בטמפרטורת החדר עד ההזרקה.
- כדי לכיל morpholino, אנחנו בדרך כלל להכין דילולים הסידורי של ריכוז המניות DDH 2 0 להניב ריכוזי העבודה של 1 מ"מ, 0.5 מ"מ, 0.25 מ"מ, 0.125mM. תלוי ברצף, באמצעות 1.8 nl נפח הזרקה, זה מייצג כ 20ng, 10ng, 5ng ו 2.5ng של morpholino לכל זריקה. זוהי רק נקודת התחלה, כיוון סובלנות והיעילות של כל morpholino תשתנה ולא ניתן לחזות. רוב morpholinos לא יורשו הרבה מעל 20 ng, אבל כמה יכול להיות יעיל במינונים הרבה מתחת ng 1. הגישה שלנו היא להגדיר את הריכוז שבה פנוטיפ "מישורים". במילים אחרות, אם פנוטיפ מוגדר לא נתפסת באמצעות 2.5 ננוגרם, אבל דומה באמצעות סכום כלשהו או מעל 5 ng, היינו בוחרים 5 ng כסכום הסף. כמובן, זה עשוי להיות שימושי כדי לכיל הבאה בין 2.5 ו - 5.0 ng ng, כדי להבטיח שאתה עובד reproducibly מעבר לסף, במקום הנכון "על הגבול".
- מלאו את המחט מחוברת מכויל(ראה לעיל) עם ריכוז העבודה הנמוך ביותר (רוב לדלל) פתרון morpholino. הימנע מעל המילוי את המחט, כפי שזה יהיה פשוט בזבוז חומר. אם למלא רק 1 μl, יש פתרון די 500 זריקות.
- בעזרת פיפטה חד פעמיות, העברת מופרית אחת תא עוברי לתוך שקתות הצלחת microinjection. הסרה של עודפי מים על מנת להבטיח כי עוברים את הנפילה לתחתית של שקתות ההזרקה. הם לא צריכים לצוף, אלא לדבוק המיטה agarose.
- מקמו את צלחת הזרקת כך micromanipulator יכול לרדת קצה המחט דרך סיסית ו בחלמון להזרקה. כדי למקם עוברי אדם, לתפעל את צלחת זריקה כזו קצה המחט להזרקת דוחף או מושך את העוברים למצב תקין. היזהר שלא לשבור את קצה מחט או עוברים נזק! זה לוקח חלק באימון, אבל בדרך כלל אתה משתמש micromanipulator פשוט להזיז את המחט בהזרקה לתוך העובר ואז לאחר ההזרקה, ולא מהר וחלק החוצה. עוברים הם הביאו למצב זריקה ידי העברת צלחת באמצעות יד חופשית שלך (שמאל אם אתם מזריקים עם יד ימין). עבור הלומד חדש, כדאי לתרגל באמצעות תמיסה המכילה פנול אדום 0.25% על מנת להמחיש את הפתרון מוזרק. אמון הוא זכה גם על ידי הזרקת תמיסה המכילה ניאון מתויג microspheres (בדיקות מולקולריות: F-8794), כדי לאשר כי הפתרון היה מוזרק העובר, ולא מרחב סיסית הבין. עם זאת, לאחר כמה סיבובים של תרגול, עזרים אלה הם בדרך כלל כבר לא נדרש. זה רעיון טוב לפעמים להזריק לחלל האוויר, רק כדי לוודא שהמחט אינה סתומים כי היקף להיות מוזרק נראה מתאים.
- עוברים מוזרק מועברים בחזרה בצלחת פטרי עם מים 100mm מערכת ותרבותי על 28.5C. לאחר הזרקה של הריכוז הנמוך עבודה, כל פתרון הנותרים ניתן לגרש את הריכוז הגבוה ביותר של עובדים הבא morpholino המשמש למילוי את המחט. חזור על כל ריכוז של morpholino. למרות שניתן לשטוף את המים בעזרת מחט, כאשר בדיקת morpholino ברורים, אנחנו מעדיפים לשנות מחטים לכייל מחדש. הקפד לשמור קבוצה של עוברי uninjected כדי לבדוק אם האצווה מסוים של עוברי היה בריא ונורמלי.
שלב 3. שיתוף הזרקת morpholinos במינונים סף הפרט
המטרה של טיטרציה ביצע לעיל היה להגדיר מינון סף לכל morpholino. ב במקרה הטוב, למעשה 100% morphants יציג פנוטיפ מוגדר, אם הגן ממוקד יש תפקיד חיוני. עם זאת, אתה יכול לצפות כמה השתנות עקב אי - זריקת חפצים. עם תרגול, זה לא יעלה על 10%. כמה קבוצות של עוברים (כולל בקרות uninjected) לא יכול לשרוד היטב, ובמקרה הניסוי ייתכן שיהיה צורך מוזלים. בינתיים, יש גם בשונות הביולוגית, שכן עוברי אדם עשוי להיות פחות או יותר סובלנית כדי מציאה. לבסוף, morpholinos מסוימים עשויים פשוט לא יהיה יעיל מספיק כדי להשיג מציאה חסון (penetrant). אם הפנוטיפ שנוצר אצל אחוז נמוך של עוברים, אך ניתנת לשחזור, היא עשויה להיות שווה בדיקה morpholino ברורים. מטרת הניסוי הבא הוא לקבוע אם פנוטיפ חדש לגמרי נתפסת כאשר שני גנים ממוקדות בו זמנית. אנחנו לא פשוט מחפש עלייה באחוז העוברים בעלי פנוטיפ morphant, אלא עבור הדור של פנוטיפ מובחן כי הוא לא ראה או מעל לרמת סף כאשר בדיקה או של גנים בודדים.
- הכינו תערובת של שילוב של morpholinos נבדק בעבר, בריכוז את סף morpholino בנפרד כי שנוצר פנוטיפ מוגדר. לדוגמה, אם את הסף עבור כל גן היה 5 ng, להכין פתרון העבודה שיכיל 5 + 5 ng ng של כל אחד (סה"כ 10 נ"ג). מאז עוברים לא יכול לסבול הרבה יותר מ -20 ננוגרם סך morpholino, חשוב, על בסיס ניסויים קודמים, להשתמש כמות מזערית של כל די ביעילות היעד כל הגן.
- בקרת צריכה לכלול קבוצות של עוברים הוזרקו בנפרד morpholino לבד בריכוז זהה ששימש השילוב. כרכים של פתרון הזרקת צריך להישמר קבוע (למשל 1.8 nl). היתרון הגדול של שימוש זן הכתב הוא שאתה יכול להעריך את הפנוטיפ (למשל בידול cardiomyocyte) בכל עת, שוב ושוב. אם הם עוברים להיבדק על ביטוי גנים על ידי הכלאה ב באתרו, בשלב בהתאמה עוברים בקרות יכול להיות קבוע בזמנים שונים שלאחר ההזרקה. לצורך ניסוי שלנו, אנחנו הולכים כדי להעריך ביטוי של GFP כתחליף בידול cardiomyocyte, בשעה hpf כ 24.
שלב 4. Eהערכת השווי של פנוטיפים
- עוברים מוזרק יש לעקוב, רק לאחר ההזרקה, וכמה פעמים במהלך היום, כדי להסיר כל עוברים מתים או גוססים, שכן אלו יכולים לסכן את הכדאיות של morphants הנותרים. כדי להעריך את הביטוי של הגן הכתב, עוברים נבחנים באמצעות מיקרוסקופ לנתח לבוש עם קיבולת פלואורסצנטי. אנו משתמשים במיקרוסקופ SMZ1500 ניקון, עם מטרה 1X או 1.6X ומגוון של הגדלה של 0.75x כדי 11.25x. בעת שימוש במסנן פלורסנט, הקפידו לפתוח את הסרעפת להגדרה פתוח כדי למקסם את עוצמת האור. כמו כן, הקפד להשתמש הסינון הנכונה, בהתאם הגן הכתב (GFP, RFP וכו ').
- עוברים הם מסומם בדרך כלל באמצעות דילול 1 / 20 במים מערכת של מניות 4mg/ml של methanesulfonate tricaine. מניות מאוחסנים קפוא ב-20C. לחלופין, ניתן עוברים מורדמים באמצעות מניות 20x tricaine. עוברים בדרך כלל יכול להיות מוקרן גם אם הם עדיין סיסית. זאת, במיוחד אם הם יצולמו, זה רעיון טוב כדי להסיר את chorions באמצעות מלקחיים חדה. עוברים ניתן לראות לאחר הצבת בשקופיות דיכאון בפתרון tricaine, או לשתק אותם טוב יותר לצילום מכניסים טיפה קטנה של methylcellulose 3%.
- שימו לב פנוטיפים העובר באותם מוזרק עם שילוב של morpholinos לעומת morphants יחיד. כאן אנחנו מחפשים דפוס הביטוי GFP בצינור לב בראשיתי. ב-GFP זה זן הכתב מתבטאת אך ורק cardiomyocytes באמצעות האמרגן cmlc2, דבר המאפשר ניתוח מפורט של מפרט לב צינור המורפוגנזה לב.
נציג תוצאות
בניסוי שלנו, הן gata5 ו gata6 morphants יחיד להראות פנוטיפים לב לשחזור כאשר הוא מוזרק עם רמות הסף, אם כי קיימת שונות ניכרת ביולוגי 3,4. לדוגמה, רוב gata5 morphants ליצור לב bifid, עם ביטוי של GFP ממוקם שני האזורים. זו מתרחשת משום אבות לב מצליחים להעביר כראוי את הפתיל על קו האמצע במהלך היווצרות צינור לב. עם זאת, חלק gata5 morphants לעשות לייצר צינור לב פגום, וכן מספר קטן (5%) יש ירידה משמעותית בכמות התאים GFP +. אנו מאמינים כי זה משקף את השתנות ביולוגי, אבל יכול להיות גם בשל העובדה כי morpholinos לא שווה מוטציה "ריק".
כמו כן, gata6 morphants כל מופע פנוטיפ לב, אבל יש מגוון של פנוטיפים כולל מספר קטן של bifid מחממת, ולבבות כי הם מורפולוגיים מופרע לעומת עוברים בקרת uninjected. השתנות זו אינה יוצאת דופן עבור פנוטיפ המוךפו"גנטי שהולך לב, מאז היווצרות הלב היא תהליך דינמי לפחות חלק פנוטיפ הלב יכול להיות בגלל עקיפה מן עובריים פגמים המוךפו"גנטי שהולך. עם זאת, חשוב מכך, מגוון של פגמים המוךפו"גנטי שהולך לב עבור morphants הן gata5 ו gata6 היא עקבית לשחזור, ועל פי רוב העוברים ליצור משמעותית + cardiomyocytes GFP.
בניגוד גמור gata5 ו gata6 morphants אחד, עוברים מדולדל של גורמים הן להראות אובדן מוחלט של ביטוי ה-GFP, עולה בקנה אחד עם הפסד של cardiomyocytes. לפיכך, gata5 ו gata6 לכל אחד מאיתנו יש לא יתירים פונקציות המורפוגנזה לב, אבל שני גנים מיותר פונקציונלי דרישה עבור הדור של cardiomyocytes מובחן. המחקרים הקודמים שלנו הראו גם הפסד של סמנים cardiomyocyte המוקדם, כולל nkx2.5, דבר המצביע על דרישה המפרט cardiomyocyte 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בניסוי המתואר כאן, אנחנו בשילוב שני morpholinos, שכל אחד מהם לבדו ליצור מגוון של פנוטיפים שונים, ומצא פנוטיפ שונה לגמרי כשהיו שיתוף מוזרק ביחד. כמובן, אנחנו צריכים להצדיק את ביצוע הניסוי הזה מלכתחילה. חשדנו כי שני גנים יכול לפצות אחד את השני עבור פונקציה קודמת, במפרט במקרה זה הלב. הסיבה לכך היא גנים קשורים מאוד (ומסוגלים מחייב את רצפי DNA זהה) באים לידי ביטוי בדפוסי חופפים במהלך embryogenesis 5. יתר על כן, ניסויים גנטיים תסיסנית ציינו כי גורמי תעתוק gata צריך להיות נדרש מפרט לב 6.
עם זאת, ישנם מצבים אחרים, כי אסטרטגיה זו עשויה לשמש לבדיקות יתירות פונקציונלית או באופן כללי יותר עבור אינטראקציות גנטיות. ראשית, מציאה של אחד או שני גנים לא יכול לחולל שום פנוטיפ ברור. במקרה זה, אין רמת הסף שהוגדרו עבור כל גן, ואת כמות morpholino להשתמש יוגדרו באופן אמפירי, מוגבל על ידי כמה הם נסבל על ידי העוברים. שוב, את הרציונל של פיצוי בדיקה סביר להניח כי יהיה זה הגנים קשורים מאוד מן המאשר שיתוף ביטוי דפוסים. שנית, אינטראקציות גנטיות ניתן לבדוק עבור כל זוג גנים באמצעות סף תת סכומי morpholinos. באסטרטגיה זו, בסכום מקסימלי שלא ליצור פנוטיפ משמש עבור כל morpholino. אם שילוב של שניהם morpholinos יוצר פנוטיפ, זה מספק ראיות חזקות אינטראקציה גנטית, למרות שהיא עשויה להיות די עקיף או אפילו לייצג מסלולים מקבילים. שלישית, שיתוף הזרקת morpholino השנייה עשויה להציל את הפנוטיפ של הראשונה, אם שני הגנים פועלים בצורה אנטגוניסטית (אשר שוב עשוי להיות עקיף). אמנם אין גבול מוגדר כמה גנים שונים יכולים להיות ממוקד, מבחינה מעשית זה כנראה הגנים 3-4, בהתאם לכמות של כל morpholino כי נדרשת תגובה הסף.
בעוד הגישה הכללית של שימוש גנטיקה הפוכה לחשוף פונקציות גן חדש יחסית תפוקה גבוהה, ישנם מספר אזהרות לשקול לגבי morpholinos. לפני שילוב morpholinos, נדרש מאמץ ניכר כדי לאמת ריאגנטים בודדים, אם זה לא כבר נעשה. כל morpholino אחד לא יכול לתפקד, בעוד אחרים יכולים ליצור את מיקוד "חפץ" פנוטיפים הקשורים במיוחד עם הפעלה של אפופטוזיס נפוצה. ריאגנטים אינם זולים, אם שניים או יותר morpholinos יש צורך לאמת את כל הגן, השקעה זו יכולה להיות משמעותית.
שיקולים אחדים עשויים להנחות את אסטרטגיית הניסוי.
i) האם יש פנוטיפ מוטנטי ידוע? אם כן, אחת pheno-העתקה morpholino צריך להספיק.
ב) האם יש נוגדן זמין? אם כן, תרגום חוסם עשוי להיות מועדף, ואם לא, זה יהיה חשוב מסמך אחוי חוסם ביעילות מטרות ה-mRNA מראש.
ג) אתה יכול להציל את morphant ידי הזרקה של ה-mRNA? אם זה עובד, זה מספק הוכחה מצוינת סגוליות morpholino. עם זאת, לעיתים קרובות לא עובד, עקב אי - המיקוד של mRNA המוזרק. הצלה עשויה גם להיבדק באמצעות transposon מבוססי transgenesis, שכן זו עשויה לאפשר שליטה מרחבית הדוק הזמני על הביטוי של הגן ממוקדות. בכל מקרה, חשוב להבטיח כי הגן הצלה אינו ממוקד על ידי morpholino.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים לחברי מעבדה אוונס על עזרתם בהכנת המצגת. Morpholinos השתמשו כאן היו תקפות במקור על ידי ד"ר אודרי Holtzinger. TE נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (HL064282 ו HL056182). ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש, של וייל קורנל מדיקל קולג'.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | ||
| Fish nets | Aquatic Habitats | ||
| System water | 60mg Instant Ocean” per liter dH2O | ||
| 100mm Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| Micropipette needle puller | Sutter Instrument Co. | P-97 Flaming/Brown | |
| 3.5" glass capillaries | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Razor blade | Personna Medical Care | 94-120-71 | |
| Micro grinder | Narishige International | EG-4 | |
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | |
| Micrometer | WARD’s Natural Science | 94 W 9910 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | |
| Disposable weigh dishes | Fisher Scientific | 2-202-B | |
| Conventional microwave | GE Healthcare | ||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552 | |
| Graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6D | |
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | |
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | |
| N2 tank | Tech Air | ||
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Parafilm | American National Can | PM-992 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’ | |
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’ | |
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’ | |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Labs | MS-222 | |
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | |
| Heat Block | Fisher Scientific | 11-718-4 | |
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | |
| Depression Microslides | VWR international | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
