Summary
وصفنا بروتوكول للنضح transcardiac إزالة والفئران وsectioning من الدماغ ، فضلا عن تلطيخ immunoperoxidase ، تضمين الراتنج ، وسامسونج sectioning من المقاطع الدماغ. عند الانتهاء من هذه الإجراءات ، والمواد immunostained مستعد للفحص المجهري مع انتقال الإلكترون.
Abstract
انتقال الإلكترون المجهر (تيم) مفيد للغاية لتصور دبقية صغيرة ، المقصورات oligodendrocytic التحت خلوية ، نجمي ، والعصبية (تغصن والعمود الفقري شجيري ، المحور ، محور عصبي عضال ، حوائط النواة) ، وكذلك على الخلايا والعضيات الهيكل الخلوي ، في الجهاز العصبي المركزي في ارتفاع القرار المكانية. جنبا إلى جنب مع تيم ، قبل تضمين كيمياء سيتولوجية مناعية يسمح للتمييز من العناصر الخلوية ذات خصائص متميزة قليلة ومعايير تحديد الهوية (على سبيل المثال ، دبقية perikarya والعمليات ، وعند استخدام الأجسام المضادة ضد علامة الخلايا الدبقية الصغيرة الخاصة Iba1 (الكالسيوم المتأينة الجزيء محول ملزمة 1 ؛ كما عرضت هنا)) ، وتحديد محتويات العصبي من العناصر الخلوية (مثل هرمون السيروتونين) ، وتوطين هذه التركيبية للبروتينات قابلة للذوبان أو الغشاء زمنيا (على سبيل المثال ، 5 ومستقبلات HT1A EphA4). هنا ، نحن تصف بروتوكول للنضح transcardiac من الفئران مع تثبيتي الأكرولين وإزالتها وsectioning من الدماغ ، فضلا عن immunoperoxidase - diaminobenzidine تلطيخ (DAB) ، التضمين الراتنج ، وسامسونج sectioning للأقسام الدماغ. عند الانتهاء من هذه الإجراءات ، والمواد immunostained مستعد لفحص مع تيم. عندما أجريت بدقة ، وهذا الأسلوب يوفر حلا وسطا بين الحفاظ ممتازة التركيبية الأمثل وكشف immunocytochemical.
Protocol
1. الحيوان نضح
- قبل يوم التروية ، وإعداد :
-- 2 لتر من الفوسفات عازلة (PB و 100 ملم ، ودرجة الحموضة 7.4) و 1 لتر من الصوديوم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS ، 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم في الجريدة الرسمية ، 50 مم ، ودرجة الحموضة 7.4) في الماء المقطر مزدوجة. تخزين برنامج تلفزيوني و1L من PB في 4 درجات مئوية. وسوف تستخدم هذه لنضح وكيمياء سيتولوجية مناعية قبل التضمين.
-- 1L بارافورمالدهيد من 4.0 ٪ (منهاج العمل ، ودرجة الحموضة 7.4) حل تثبيتي ، والتي ستمكن نضح من 6 الفئران. لهذا الغرض ، تسخين 1 لتر من PB تحت غطاء الدخان. تزن 40 غراما من بارافورمالدهيد الحبيبية (PFA) وتصب في حل PB عندما يصل إلى 60 درجة مئوية. عندما حل واضح ، مع PFA حله تماما ، بارد لدرجة حرارة الغرفة (RT) وتخزينها في 4 درجات مئوية. - في يوم التروية ، وإعداد 500 مل من محلول 3.5 ٪ في الأكرولين PB تحت غطاء الدخان. ثم ، تصفية الأكرولين 3.5 ٪ و 4.0 ٪ حلول PFA استعمال ورق الترشيح.
- الماوس للتخدير ، وضخ بنتوباربيتال الصوديوم (80 ملغ / كلغ) في الصفاق مع قياس 27 ½ "إبرة.
- خلال التروية ، و 50 مل من برنامج تلفزيوني ، سيكون 75 مل من الأكرولين ، و 150 مل من PFA تمرير بالتسلسل إلى الدورة الدموية الماوس. لاقامة مضخة تمعجية ، وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني والإصلاح مقياس 23 ¾ "فراشة إبرة في نهاية واحدة. تزج الطرف الآخر من الأنبوب إلى حل التروية (PBS ، أو الأكرولين PFA). تعيين سرعة تمعجية مضخة ل20-25 مل / دقيقة بالنسبة للفئران الأحداث والبالغين. طوال التروية ، وتجنب بعناية أي فقاعات من الهواء يتشكل في الأنابيب.
- انتظر حتى الماوس مخدرة لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة ، مثل قرصة الذيل ، وقبل المضي قدما. وضع الحيوانات في علبة تشريح وتحديد الكفوف باستخدام الشريط. مع ملاقط ومقصات ، وتفتح البشرة وتجويف الصدر للكشف عن القلب. للحد من نقص تروية الدماغ ، ونضح يحتاج إلى أن تبدأ بسرعة. خفض فتح الأذين الأيمن مع مقص صغير وبدء ضخ تمعجية. في حين عقد القلب مع ملاقط ، تضاف إبرة فراشة في قمة البطين الأيسر.
- عند تغيير الحل ، ووقف ضخ تمعجية ، ونقل الأنبوب من حل واحد لآخر ، وإعادة تشغيل المضخة على الفور.
- عند 150 مل PFA مرت ، ووقف ضخ تمعجية. باستخدام مقص صغير ، وقطع رأسه ، وفتح الجلد ، وكسر في الجمجمة بين العينين. استخدام ملاقط صغيرة ، ورقاقة بعناية قطع صغيرة من الجمجمة حتى يمكن إزالتها بسهولة الدماغ. بعد إصلاح الدماغ لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية في منهاج العمل. تغسل 3 مرات في 10 دقيقة برنامج تلفزيوني.
- قطع على الفور في الدماغ عرضية (50 ميكرون سميكة المقاطع) في جليد تبريد PBS باستخدام vibratome. بفرشاة غرامة ، ونقل المقاطع المختارة للكيمياء سيتولوجية مناعية في قارورة زجاجية تحتوي على برنامج تلفزيوني. تخزين المقاطع المتبقية في -20 درجة مئوية في cryoprotectant (30 ٪ جلايكول الإثيلين والجلسرين بنسبة 30 ٪ في PBS) لمدة تصل إلى عدة سنوات.
2. قبل تضمين كيمياء سيتولوجية مناعية
- للكيمياء سيتولوجية مناعية ، تتم معالجة أقسام عائمة بحرية في قوارير زجاجية. في جميع أنحاء الداخلي ، ويحتاج المرء لتجنب بعناية السماح المقاطع تجف.
- أولا ، إزالة برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة نقل واستبدالها فورا بمحلول جديدة من بوروهيدريد الصوديوم 0.1 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT.
- شطف مع أقسام PBS 3 مرات 10 دقيقة ، وإزالة جميع فقاعات ، واحتضان لمدة 2 ساعة على RT في محلول يحتوي على حجب PBS 0.5 ٪ الجيلاتين والمصل العادي 5 ٪ من الحيوانات في جسم الثانوية التي ولدت (مصل طبيعي في الماعز على سبيل المثال الحالي immunostaining - Iba1).
- احتضان لمدة 48 ساعة مع الضد الرئيسي في عرقلة الحل. لimmunostaining - Iba1 ، استخدم أرنب المضادة للIba1 الأضداد (1:1000).
- شطف مع أقسام PBS 3 مرات 10 دقيقة واحتضان الضد في الثانوية مترافق لالبيوتين (1:1000) في عرقلة الحل لمدة 2 ساعة على RT.
لimmunostaining - Iba1 ، واستخدام الماعز المضادة للأرنب الجماعات الحكومية الدولية. - شطف مع أقسام PBS 3 مرات 10 دقيقة في احتضان وstreptavidin - الفجل البيروكسيداز (1:1000) في عرقلة الحل : 1 ساعة بمعدل RT.
- شطف المقاطع مع 10 دقائق مع برنامج تلفزيوني وتريس / حمض الهيدروكلوريك ، مخزنة المالحة (TBS و 50 مم ، درجة الحموضة 7.4) 2 مرات 10 دقيقة. لتكشف عن وضع العلامات ، واحتضان المقاطع مع DAB 0.05 ٪ و 0.01 ٪ بيروكسيد الهيدروجين في TBS (حل الطازجة). عندما تلطيخ هو اللون البني الغامق (انظر المثال في الشكل 1) ، والتوقف عن رد الفعل من قبل الشطف في TBS. في أي حال ، رد الفعل بعد نهاية مدة أقصاها 5 دقائق. شطف المقاطع مع 10 دقيقة مع وTBS PB 2 مرات 10 دقائق.
3. التجهيز للفحص المجهري الإلكترون
- نقل المقاطع في الجريدة الرسمية في لوحة الثقافة multiwell باستخدام فرشاة دقيقة. إعداد 1 ٪ حل رباعي أكسيد الأوزميوم في الجريدة الرسمية تحت غطاء دخن. إزالة PB من الآبار من لوحة والثقافة نشر مقاطع شقة بفرشاة دقيقة. تزج فورا المقاطع في الأوزميوم 1 ٪ لمدة 30 دقيقة في RT.
- نقل المقاطع في قوارير الزجاج ، وشطف مع PB 3 مرات 10 دقيقة ، ويذوى دقائق عن طريق الغمر 2 في الصعود تركيزات الايثانول : 2 مرات 35 ٪ ، و 1 في كل مرة من 50 ٪ ، 70 ٪ ، 80 ٪ ، 90 ٪ ، و 95 ٪ ، و 3 مرات 100 ٪ ، تليها 3 مرات أكسيد البروبيلين.
- لإعداد Durcupan الراتنج ، والجمع بين 20 غراما من العنصر A ، B 20 غراما من العنصر ، و 0.6 غرام من المكون جيم ، و 0.4 غرام من عنصر دال في دورق المتاح ، وتخلط جيدا حتى يصبح لون موحد ، وتصب من الألمنيوم تزن الطبق. إذا لزم الأمر ، يمكن أن تكون على استعداد كتل الراتنج الراتنج بصب قوالب والتضمين في علاج 55 في فرن درجة مئوية ل48-72 ساعة.
- باستخدام فرشاة مع غرامة تشطف أكسيد البروبيلين ، وإزالة المقاطع من أكسيد البروبيلين وتزج في الراتنج Durcupan ليلة وضحاها في التشريب RT.
- في اليوم التالي ، وضعت في صحن الألمنيوم تزن فرن 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتليين الراتنج. باستخدام فرشاة تشطف مع أكسيد البروبيلين ، ومعطف فيلم تضمين ACLAR بطبقة رقيقة من الراتنج ، والقاء المقاطع ، وتغطي مع فيلم آخر التضمين ، وتوزيعها بالتساوي الأوزان الخفيفة (حوالي 2 غرام ، على سبيل المثال أغطية بلاستيكية من قوارير الزجاج) على رأس لمساعدة الراتنج الانتشار. لبلمرة الراتنج ، واحتضان في الفرن لمدة 48-72 ساعة (عند درجة حرارة 55 مئوية).
- بعد البلمرة ، إزالة الأوزان الخفيفة وتضمين الفيلم في الجزء العلوي من الأبواب. تحت المجهر مجهر ، حدد مربع من المناطق الفائدة (حوالي ملم 2x2) من المكوس وبعناية من الفيلم باستخدام شفرة حلاقة.
- الغراء في المجالات ذات الاهتمام على طرف باستخدام كتل الراتنج Superglue والعلاج في الفرن 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- استعدادا لsectioning ، وتقليم كتلة راتنج على شكل شبه منحرف متساوي الساقين لبشفرة حلاقة.
- مشراح مستدق باستخدام سكين والزجاج ، وإزالة الصمغ والراتنج على سطح النسيج. ملء القارب من السكين والزجاج المزدوج مع الماء المقطر وخفض عدد قليل من شبه رقيقة المقاطع (0.5-1 ميكرومتر سميكة).
- نقل المقاطع إلى شريحة SuperFrost مع حلقة الكمال. الجافة المقاطع من خلال وضع الشريحة على لوحة التدفئة بنسبة 80 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. غلاف مع بضع قطرات من 0.1 ٪ طولويدين الزرقاء وصمة عار (2 بورات الصوديوم و 0.2 ز ز طولويدين الزرقاء في 200 مل من الماء المقطر المزدوج) لمدة 1 دقيقة. شطف الزائدة وصمة عار مع الماء المقطر مزدوجة. وفحص الأجزاء مع مجهر ضوء تمكين لتمييز الأنسجة الملون من الراتنج (الشكل 2).
- استئناف قطع حتى الحدود بين الأنسجة والراتنج يصل إلى منتصف المقاطع. نلاحظ أن الإجراء التالي يتطلب التدريب. استبدال الزجاج سكين بسكين الماس وملء القارب بالماء المقطر مزدوجة. قطع الفضة الى اقسام سامسونج الفضة والذهب (60-80 نانومتر سميكة) وجمع لهم بعناية على شبكات سلكية النحاس باستخدام الملقط مقلوب الغرامة. تجفيف شبكات على ورق الترشيح.
- لتعزيز النقيض من ذلك ، يمكن سامسونج ملطخة المقاطع مع سترات الرصاص (0.03 سترات الرصاص و 0.1 مل ز هيدروكسيد الصوديوم 10N في 10 مل من الماء المقطر المزدوج 1). باستخدام الملقط مقلوب غرامة ، وتحويل الشبكة إلى قطرة من سترات الرصاص لمدة 2 دقيقة. إزالة الشبكة وشطف بدقة في 3 حمامات متعاقبة من الماء المقطر مزدوجة. أخيرا ، تجفيف شبكات على ورقة الترشيح وتخزينها في المربع الشبكة حتى الفحص المجهري الإلكترون (الشكلان 3-6).
4. ممثل النتائج
الشكل 1. Iba1 الملطخة الباب على المستوى المجهري الخفيفة. ويقتصر توزيع الخلوي للIba1 إلى الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يدل على خصوصية immunostaining. مقياس بار = 100 ميكرومتر.
الشكل 2. طولويدين الزرقاء الملطخة شبه رقيقة المقطع على مستوى المجهرية الخفيفة. لاحظ الحدود بين الأنسجة والراتنج حيث immunostaining سيظهر على أشده في المجهر الالكتروني.
القسم سامسونج الرقم 3. يظهر Iba1 - immunopositive حوائط النواة دبقية صغيرة والعمليات على المستوى المجهري الإلكترون. يتم التعرف على العناصر الهيكلية التي Iba1 إيجابية على يعجل الإلكترونات كثيفة immunoperoxidase - DAB. مقياس شريط = 2 ميكرون.
القسم سامسونج الرقم 4. عرض Iba1 - immunopositive العمليات دبقية صغيرة من مختلف الأحجام والأشكال على المستوى المجهري الإلكترون. مقياس شريط = 2 ميكرون.
ه 5 "/>
الشكل 5. سامسونج المقطع يظهر في أعلى التكبير عملية Iba1 إيجابية دبقية صغيرة من الشكل (4) ، مما يتيح له التعرف على عضيات داخل الخلايا. مقياس بار = 1 ميكرون.
الشكل 6. سامسونج تكشف المقطع في أعلى التكبير العلاقات التركيبية بين عملية Iba1 إيجابية دبقية صغيرة والعناصر القريبة neuropil بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي. مقياس شريط = 1μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا قد وصفنا على بروتوكول لإعداد الماوس لأنسجة المخ immunoelectron المجهري الذي يوفر حلا وسطا بين الحفاظ ممتازة التركيبية الأمثل وكشف immunocytochemical ، عندما يتم تنفيذها بدقة الإجراءات.
جنبا إلى جنب مع تيم ، وهذه الطريقة تمكن من التمييز بين العناصر الخلوية ذات خصائص متميزة قليلة ومعايير تحديد الهوية. على وجه الخصوص ، وتلطيخ immunoperoxidase - DAB للتمكن من تحديد Iba1 perikarya دبقية صغيرة والعمليات داخل neuropil ، وكذلك لتحليل مورفولوجيا بهم ، العضيات الخلوية ، والعلاقات التركيبية مع العناصر الخلوية الأخرى (الشكلان 3-6). بالإضافة إلى ذلك ، يسمح هذا البروتوكول تحليل المواقع التركيبية للبروتينات قابلة للذوبان أو الغشاء ملزمة في العناصر الدبقية أو العصبية ، فضلا عن ارتباطها عضيات داخل الخلايا. في الواقع ، وذلك باستخدام هذا البروتوكول مع الاجسام المضادة المحددة ، وقد كشفت لنا سابقا توطين التركيبية للHT1A - 5 - 5 ومستقبلات هرمون السيروتونين HT1B perikarya في الخلايا العصبية ، التشعبات ، العمود الفقري شجيري ، المحاوير كمون الفعل ، والخلايا البطانية من البالغين نواة الرفاء الظهري الفئران ، substantia أسود ، الكرة الشاحبة ، والحصين 2. لقد أظهرنا أيضا توطين التركيبية للEphA4 EphB2 ومستقبلات التيروزين كيناز في clathrin الحويصلات المغلفة ومختلف عناصر نجمي والخلايا العصبية في قرن آمون والفأر والجرذ القشرة الدماغية ، أثناء التطور بعد الولادة والبلوغ 3،4،5،6. أخيرا ، يمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع ما قبل التضمين immunogold لتحليل العلاقات التركيبية بين نوعين من البروتين المسمى واحد ، على سبيل المثال ، شارك في توطين Vglut1 نقل glutamatergic ومستقبلات EphA4 في محطات محوار من الماوس الكبار قشرة الدماغ 6. ولذلك ، يمكن تطبيق هذه التقنية بنجاح ، بمفرده أو بالاشتراك مع وضع العلامات immunogold ، لتحليل البروتينات التركيبية المختلفة في المناطق المختلفة وأنواع من خلايا الجهاز العصبي المركزي ، في جميع مراحل الحياة ما بعد الولادة ، في الصحة والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر شاو مينغ وليو هاريس Gelbard ألف لاستخدام مضخة تمعجية وvibratome ، وكذلك كارين L. بنتلي وغايل شنايدر في مرفق مجهر إلكترون الأساسية للبحوث التابع لجامعة روتشستر المركز الطبي لتقديم المساعدة التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (EY019277) ، ومؤسسة وايتهول ، بوروز صندوق ويلكوم ، وألفريد سلون P. المؤسسة لبأنقرة. M.-È.T. وتمول من قبل دي فون LA RECHERCHE EN كيبيك سانتي (FRSQ) ما بعد الدكتوراه جائزة التدريب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | OVATION Pharmaceuticals | ||
| Filter paper 315 24 cm | VWR international | 28331-081 | |
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich | 01680 | |
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich | 452173 | |
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich | 82325 | |
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher Scientific | 01-291-10 | |
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher Scientific | NC9261784 | |
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | |
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Gelatin subbed slides | VWR international | 100241-864 | |
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Capsule mold | Electron Microscopy Sciences | 70150 | |
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | |
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | |
| Superfrost slides | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | ||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich | G7765 | |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly. |
|||
References
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
