Voorbereiding van de muis hersenweefsel voor Immunoelectron Microscopie

Abstract

Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) is uiterst nuttig voor het visualiseren van microglia, oligodendrocytic, astrocytaire, en neuronale subcellulaire compartimenten (dendriet, dendritische wervelkolom, axon, axon terminal, perikaryon), evenals hun intracellulaire organellen en cytoskelet, in het centrale zenuwstelsel bij hoge ruimtelijke resolutie. In combinatie met TEM, pre-embedding immunocytochemie kan de discriminatie van cellulaire elementen met weinig onderscheidende kenmerken en identificatie criteria (bv. microgliale perikarya en processen, bij het gebruik van een antilichaam tegen de microglia-specifieke marker Iba1 (geïoniseerd calcium binding adapter molecuul 1; zoals gepresenteerd hier)), het identificeren van de neurotransmitter inhoud van cellulaire elementen (bijvoorbeeld serotonine) en hun ultrastructurele lokalisatie van oplosbare of membraan-gebonden eiwitten (bijv. 5 HT1A en EphA4 receptoren). We beschrijven hier een protocol voor transcardiac perfusie van muizen met acroleïne fixatief, verwijdering en snijden van de hersenen, evenals immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) kleuring, hars inbedding, en de ultradunne snijden van de hersenen secties. Na voltooiing van deze procedures, de immunostained materiaal klaar is voor onderzoek met TEM. Bij het rigoureus uitgevoerd, deze techniek biedt een uitstekend compromis tussen optimale ultrastructurele behoud en immunocytochemische detectie.

Protocol

1. Dier perfusie

1. Op de dag voor perfusie, voor te bereiden:
   - 2 L van fosfaatbuffer (PB, 100 mM, pH 7,4) en een L van natrium fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, 0,9% NaCl in 50 mM PB, pH 7,4) in dubbel gedistilleerd water. Bewaar de PBS en 1L van PB bij 4 ° C. Deze zullen worden gebruikt voor perfusie en pre-inbedding immunocytochemie.
   - 1L van 4,0% paraformaldehyde (PFA, pH 7.4) fixatief oplossing, die de doorbloeding van 6 muizen in staat zal stellen. Voor dat doel, warmen een L van PB in een zuurkast. Weeg 40 g van granulaire paraformaldehyde (PFA) en giet in de PB-oplossing bij het bereiken van 60 ° C. Wanneer de oplossing helder is, met de PFA volledig is opgelost, afkoelen tot kamertemperatuur (RT) en bewaar bij 4 ° C.
2. Op de dag van perfusie, voor te bereiden 500 ml van 3,5% acroleïne oplossing in PB onder een zuurkast. Dan, filter de 3,5% acroleïne en 4,0% PFA oplossingen met behulp van papieren filter.
3. Voor muis anesthesie, injecteren natriumpentobarbital (80 mg / kg) in het peritoneum van een 27 gauge ½ "naald.
4. Tijdens de perfusie, 50 ml PBS, wordt 75 ml van acroleïne, en 150 ml PFA achtereenvolgens overgaan in de muis circulatie. Voor het instellen van de peristaltische pomp, vul de buis met PBS en vast een 23 gauge ¾ "vlindernaald aan een kant. Dompel het andere uiteinde van de slang in de perfusie-oplossing (PBS, acroleïne of PFA). Stel de snelheid van de peristaltische pomp tot 20-25 ml / min voor jeugdige en volwassen muizen. Gedurende de perfusie, zorgvuldig alle luchtbellen vormen in de slang te voorkomen.
5. Wacht tot de verdoofd muis niet meer reageert op pijnprikkels, zoals een staart knijpen, voordat u verder gaat. Leg het dier in een dissectie lade en bevestig de poten met behulp van tape. Met een pincet en schaar, het openstellen van de huid en borstkas naar het hart bloot te leggen. Te minimaliseren hersenen ischemie, de perfusie moet snel worden gestart. Opengesneden de rechter atrium met een klein schaartje en start de peristaltische pomp. Terwijl het hart met een pincet, steek de vlinder naald in de apex van de linker hartkamer.
6. Bij het wijzigen van oplossing, stop de peristaltische pomp, overdracht van de slang van een oplossing naar de andere, en onmiddellijk start de pomp.
7. Wanneer 150 ml PFA is verstreken, stopt de peristaltische pomp. Met behulp van kleine schaar, sneed het hoofd, het openstellen van de huid, en breken de schedel tussen de ogen. Met behulp van kleine pincet voorzichtig chip uit kleine stukjes van de schedel tot aan de hersenen kan gemakkelijk worden verwijderd. De hersenen voor 2 uur na de vast te stellen op 4 ° C in PFA. Was drie keer 10 minuten in PBS.
8. Onmiddellijk snijd de hersenen in dwarsrichting (50 pm dik secties) in ijs gekoeld met behulp van een PBS vibratome. Met een fijn penseel, transfer secties geselecteerd voor immunocytochemie in een glazen flacon met PBS. Bewaar de overige secties bij -20 ° C in cryoprotectant (30% ethyleenglycol en 30% glycerol in PBS) tot enkele jaren.

2. Pre-inbedding immunocytochemie

1. Voor immunocytochemie, zijn artikelen zijn verwerkt vrij zwevend in glazen flesjes. Tijdens de gehele procedure, moet men zorgvuldig te vermijden dat delen uitdrogen.
2. Verwijder eerst de PBS met behulp van een overdracht pipet en onmiddellijk vervangen door een verse oplossing van 0,1% natriumboorhydride in PBS gedurende 30 minuten bij RT.
3. Spoel secties met PBS 3 maal 10 minuten, het verwijderen van alle bubbels, en incubeer gedurende 2 uur bij RT in een blokkerende oplossing van PBS met 0,5% gelatine en 5% normaal serum van het dier waarbij het secundaire antilichaam werd gegenereerd (normaal geit serum in de huidige voorbeeld van Iba1-immunokleuring).
4. Incubeer gedurende 48 uur met primaire antilichaam in het blokkeren van oplossing. Voor Iba1-immunokleuring, gebruik van konijnen anti-Iba1 antilichaam (1:1000).
5. Spoel secties met PBS 3 keer 10 minuten en incubeer in het secundair antilichaam geconjugeerd aan biotine (1:1000) in het blokkeren oplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
   Voor Iba1-immunokleuring, gebruik van geit anti-konijn IgGs.
6. Spoel secties met PBS 3 keer 10 minuten en incubeer in streptavidine-mierikswortelperoxidase (1:1000) in het blokkeren oplossing gedurende 1 uur bij RT.
7. Spoel secties met PBS 10 minuten en met Tris / HCl gebufferde zoutoplossing (TBS, 50 mM, pH 7,4) 2 maal 10 minuten. Te onthullen op het etiket, incubeer secties met 0,05% DAB en 0,01% waterstofperoxide in TBS (oplossing vers bereid). Als de kleuring is donker-bruin (zie voorbeeld in Figuur 1), stop de reactie door spoelen in TBS. In ieder geval, het einde van de reactie na een maximum van 5 minuten. Spoel delen met TBS 10 minuten en met PB 2 maal 10 minuten.

3. Verwerking voor elektronenmicroscopie

1. Overdracht secties in PB in een multiwell cultuur plaat met een fijne borstel. Bereid 1% osmium tetroxide oplossing in PB onder een rokende motorkap. Verwijder PB uit de bronnen van de cultuur plaat en verspreiden de secties plat met een fijne borstel. Onmiddellijk onder te dompelen secties in 1% osmium gedurende 30 minuten bij RT.
2. Breng de onderdelen in glazen flesjes, spoelen met PB 3 maal 10 minuten, en uitdrogen door middel van 2 minuten onderdompelen in oplopende concentraties van ethanol: 2 keer 35%, 1 keer elk van de 50%, 70%, 80%, 90%, en 95 %, 3 maal 100%, gevolgd door 3 keer propyleenoxide.
3. Ter voorbereiding van de Durcupan hars, combineren 20 g van de component A, 20 g van de component B, 0,6 g onderdeel C, en 0,4 g van de component D in een wegwerp beker, meng goed tot de kleur wordt uniform, en giet het in een aluminium wegen schotel. Indien nodig, kan hars blokken worden voorbereid door het gieten van hars in mallen inbedding en uitharding in een 55 ° C oven voor 48-72 uur.
4. Met behulp van een fijn penseel gespoeld met propyleenoxide, de secties van de propyleenoxide en dompel 's nachts te verwijderen in de Durcupan impregnatiehars voor bij RT.
5. De volgende dag, zet de aluminium wegen schotel in een 55 ° C oven gedurende 10 minuten om de hars te verzachten. Met behulp van een borstel gespoeld met propyleenoxide, jas een Aclar inbedding film met een dun laagje van de hars, ging de secties, te dekken met een andere inbedding film, en gelijkmatig lichte gewichten (ongeveer 2 g, bijvoorbeeld de plastic doppen van de glazen flacons) verspreiden op de top te helpen hars verspreiden. Voor hars polymerisatie, incuberen in de oven gedurende 48-72 uur (bij 55 ° C).
6. Na de polymerisatie, verwijder de lichte gewichten en inbedding film op de top van de secties. Onder een binoculaire microscoop, selecteer vierkante gebieden van belang (ongeveer 2x2 mm) en zorgvuldig accijnzen ze uit de film met behulp van een scheermesje.
7. Lijm op het gebied van de belangstelling op het puntje van de hars met behulp van blokken Superglue en genezing in de 55 ° C oven gedurende 1 uur.
8. Ter voorbereiding op het snijden, trim de hars blok naar de vorm van een gelijkbenige trapezium met een scheermesje.
9. Met behulp van een ultramicrotoom en een glas mes, verwijder de lijm en hars aan het oppervlak van het weefsel. Vul de boot van het glas mes met dubbel gedestilleerd water en snij een paar semi-dunne secties (0,5-1 micrometer dik).
10. Overdracht van de sectie om een ​​SuperFrost dia met een perfecte loop. Droog de onderdelen door het plaatsen van de dia op een verwarmingsplaat bij 80 ° C gedurende 1 minuut. Dek af met een paar druppels van 0,1% toluïdineblauw vlek (2 g natriumboraat en 0,2 g toluïdineblauw in 200 ml dubbel gedestilleerd water) gedurende 1 minuut. Spoel de overtollige vlek met tweemaal gedestilleerd water. Onderzoek van de secties met een lichtmicroscoop zal toelaten om het gekleurde weefsel te onderscheiden van de hars (figuur 2).
11. Hervatten snijden tot aan de grens tussen weefsel en hars bereikt het midden van de secties. Merk op dat de volgende procedure opleiding vereist. Vervang het glas mes met een diamanten mes en vul de boot met tweemaal gedestilleerd water. Gesneden zilver naar zilver-goud ultradunne secties (60-80 nm dik) en zorgvuldig te verzamelen over kopergaas roosters met fijne omgekeerde pincet. Droog de roosters op een papieren filter.
12. Om het contrast te verbeteren, kan ultradunne secties worden gekleurd met lood citraat (0,03 g lood citraat en 0,1 mL 10N natriumhydroxide in 10 ml dubbel gedestilleerd water ^1). Met behulp van fijne omgekeerde pincet, overdracht een rooster tot een daling van lood citraat gedurende 2 minuten. Verwijder het rooster en delicaat spoelen in drie opeenvolgende baden van dubbel gedestilleerd water. Ten slotte, droog de roosters op een filtreerpapier en bewaar ze in een raster doos tot elektronen microscopisch onderzoek (figuren 3-6).

4. Representatieve resultaten

Figuur 1. Iba1-gekleurde sectie aan het licht microscopisch niveau. De cellulaire distributie van Iba1 is beperkt tot microglia, die de specificiteit van de immunokleuring shows. Schaalbalk = 100 micrometer.

Figuur 2. Toluidine blauw-gekleurde semi-dunne gedeelte aan het licht microscopisch niveau. Let op de grens tussen weefsel en hars, waar de immunokleuring zullen de meeste intense verschijnen op de elektronenmicroscoop.

Figuur 3. Ultradunne sectie toont Iba1-immunopositive microgliale perikaryon en processen op het elektron microscopisch niveau. Iba1-positieve structurele elementen zijn te herkennen aan hun immunoperoxidase-DAB electron-dense neerslag. Schaalbalk = 2 micrometer.

Figuur 4. Ultradunne sectie tonen Iba1-immunopositive microgliale processen van verschillende maten en vormen op het elektron microscopisch niveau. Schaalbalk = 2 micrometer.

e 5 "/>
Figuur 5. Ultradunne sectie toont bij hogere vergroting een Iba1-positieve microgliale proces van figuur 4, zodat de identificatie van de intracellulaire organellen. Schaal bar = 1 micrometer.

Figuur 6. Ultradunne sectie onthullende bij hogere vergroting van de ultrastructurele relaties tussen een Iba1-positieve microgliale proces en nabijgelegen elementen van neuropil waaronder synapsen. Schaalbalk = 1 uM.

Discussion

Hier hebben we beschreven een protocol voor de voorbereiding van de hersenen van muizen weefsel voor immunoelectron microscopie, dat een uitstekend compromis tussen optimale ultrastructurele behoud en immunocytochemische detectie, wanneer de procedures zorgvuldig worden uitgevoerd biedt.

In combinatie met TEM, deze methode maakt het mogelijk om onderscheid te maken cellulaire elementen met weinig onderscheidende kenmerken en identificatie criteria. Met name de immunoperoxidase-DAB kleuring van Iba1 in staat stelt om microglia perikarya en processen te identificeren, binnen de neuropil, alsook aan hun morfologie, intracellulaire organellen, en ultrastructurele relaties met andere cellulaire elementen (figuren 3-6) te analyseren. Bovendien, dit protocol kan het analyseren van de ultrastructurele locaties van oplosbare of membraan-gebonden eiwitten in gliale of neuronale elementen, evenals hun associatie met intracellulaire organellen. Inderdaad, met behulp van dit protocol met specifieke antilichamen, hebben we al eerder gebleken dat de ultrastructurele lokalisatie van 5-HT1A en 5-HT1B serotonerge receptoren in de neuronale perikarya, dendrieten, dendritische spines, niet-gemyeliniseerde axonen, en endotheelcellen van volwassen ratten raphe dorsalis kern, substantia nigra, globus pallidus, en de hippocampus ^2. We hebben ook aangetoond dat het ultrastructurele lokalisatie van EphA4 en EphB2 tyrosine kinase receptoren in clathrine-gecoate blaasjes en verschillende astrocytaire en neuronale elementen in muizen en ratten hippocampus en cerebrale cortex, tijdens de postnatale ontwikkeling en volwassenheid ^3,4,5,6. Ten slotte kan dit protocol worden gecombineerd met pre-embedding immunogold aan de ultrastructurele relaties tussen twee gelijktijdig gelabelde eiwitten te analyseren, bijvoorbeeld de co-lokalisatie van Vglut1 glutamaat transporter en EphA4 receptor in axon terminals van de volwassen muis cerebrale cortex ^6. Daarom kan deze techniek met succes worden toegepast, alleen of in combinatie met immunogold etikettering, voor de ultrastructurele analyse van de verschillende eiwitten in verschillende regio's en celtypes van het centrale zenuwstelsel, het hele postnatale leven, in gezondheid en ziekte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium pentobarbital (Nembutal)	OVATION Pharmaceuticals
Filter paper 315 24 cm	VWR international	28331-081
*Acrolein purum (≥95%)	Sigma-Aldrich	01680
Sodium borohydride (≥98%)	Sigma-Aldrich	452173
*Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%)	Sigma-Aldrich	441244
Normal goat serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Rabbit anti-Iba1 primary antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	019-19741	Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific	Jackson ImmunoResearch	111-066-046	Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Peroxidase-conjugated streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-030-084	Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
*Osmium tetroxide 4% solution	Electron Microscopy Sciences	19150	Light sensitive
Propylene oxide (≥99%)	Sigma-Aldrich	82325
Polypropylene disposable beakers (50 mL)	Fisher Scientific	01-291-10
Aluminium weigh dishes (70 mm)	Fisher Scientific	NC9261784
Durcupan epoxy resin	Electron Microscopy Sciences	14040
Embedding mold	Electron Microscopy Sciences	70907
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	44581
Gelatin subbed slides	VWR international	100241-864
ACLAR embedding films (7.8 mm)	Electron Microscopy Sciences	50425
Capsule mold	Electron Microscopy Sciences	70150
High-performance super glue	Corporate Express	LOC30379
Perfect loop for ultra thin sections	Electron Microscopy Sciences	70944
Superfrost slides	Fisher Scientific	22-178-277
Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm)	Diatome
Gelatin from cold water fish skin (~45%)	Sigma-Aldrich	G7765
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.