Summary
אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
Abstract
הילוכים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הוא מאוד שימושי עבור חזותי microglial, תאים subcellular oligodendrocytic, astrocytic, ואת עצבי (דנדריט, עמוד השדרה דנדריטים, האקסון, האקסון לטרמינל, perikaryon), כמו גם אברונים תאיים שלהם cytoskeleton, במערכת העצבים המרכזית ברזולוציה מרחבית גבוהה. בשילוב עם TEM, טרום הטבעה immunocytochemistry מאפשר את האפליה של אלמנטים הסלולר עם מאפיינים בולטים כמה קריטריונים הזדהות (למשל, microglial perikarya ותהליכים, כאשר באמצעות נוגדן כנגד סמן microglia ספציפית Iba1 (סידן מיונן מחייב מתאם המולקולה 1, כפי שהוצגו כאן)), זיהוי תוכן הנוירוטרנסמיטר של אלמנטים הסלולרי (למשל, serotonergic) ולוקליזציה ultrastructural שלהם של חלבונים מסיסים או קרום הנכנס (למשל, 5 ו HT1A EphA4 קולטנים). כאן אנו מתארים פרוטוקול זלוף transcardiac של עכברים עם acrolein מקבע, הסרת חתך של המוח, כמו גם אימונו-diaminobenzidine (DAB) מכתים, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של בסעיפים המוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן לבדיקה עם TEM. כאשר מבוצע בקפידה, טכניקה זו מהווה פשרה מצוינת בין שימור ultrastructural אופטימלית זיהוי immunocytochemical.
Protocol
1. בעלי חיים זלוף
- ביום שלפני זלוף, להכין:
- 2 ליטר של חיץ פוספט (PB, 100 מ"מ, pH 7.4) ו - 1 ליטר של סודיום פוספט בופר סליין (PBS; 0.9% NaCl ב 50 מ"מ PB, pH 7.4) במים מזוקקים כפול. חנות PBS ו 1 ליטר של PB ב 4 ° C. אלה ישמשו זלוף והטבעה מראש immunocytochemistry.
- 1 ליטר של paraformaldehyde 4.0% (PFA, pH 7.4) מקבע פתרון, אשר יאפשר זלוף של 6 עכברים. לשם כך, לחמם 1 ליטר מתחת למכסה המנוע של PB קטר. שקול 40 גרם של גרגירי paraformaldehyde (PFA) ויוצקים לתוך הפתרון PB כאשר הוא מגיע 60 ° C. כאשר הפתרון הוא ברור, עם PFA נמס לגמרי, להתקרר לטמפרטורת החדר (RT) ולאחסן ב 4 ° C. - ביום זלוף, להכין 500 מ"ל של תמיסת acrolein 3.5% ב PB מתחת למכסה המנוע קטר. ואז, המסנן acrolein 3.5% ו -4.0% באמצעות פתרונות PFA נייר הסינון.
- עבור הרדמה העכבר, להזריק נתרן pentobarbital (80 מ"ג / ק"ג) תוך הצפק עם מד 27 ½ "מחט.
- במהלך זלוף, 50 מ"ל של PBS, 75 מ"ל של acrolein, ו -150 מ"ל של PFA יהיה ברצף לעבור למחזור העכבר. כדי להגדיר את המשאבה peristaltic, למלא את צינורות עם PBS ולתקן מד 23 ¾ "מחט פרפר בקצה אחד. לטבול את הקצה השני של הצינור לתוך הפתרון זלוף (PBS, acrolein או PFA). קבע את המהירות של peristaltic משאבת 20-25 mL / min עבור עכברים צעירים ומבוגרים. ברחבי זלוף, בזהירות למנוע בועות אוויר להרכיב בצינור.
- המתן עד העכבר מורדם כבר לא מגיב לגירויים מכאיבים, כגון צביטה זנב, לפני שתמשיך. הנח את החיה מגש לנתיחה ולתקן את הכפות באמצעות קלטת. עם פינצטה ומספריים, לפתוח את עור החזה כדי לחשוף את הלב. כדי למזער איסכמיה, זלוף צריך להיות נכתבו במהירות. גזור לפתוח את אטריום ימין עם מספריים קטנים להתחיל את המשאבה peristaltic. בעוד מחזיק את הלב עם פינצטה, הכנס את המחט לתוך פרפר לשיא של החדר השמאלי.
- בעת שינוי הפתרון, להפסיק את המשאבה peristaltic, להעביר את צינורות מפתרון אחד למשנהו, ולהפעיל מחדש את המשאבה מיד.
- כאשר 150 מ"ל של PFA עבר, להפסיק את המשאבה peristaltic. בעזרת מספריים קטנים, חותכים את הראש, לפתוח את העור, לשבור את הגולגולת בין העיניים. בעזרת פינצטה קטנה, שבב בזהירות את חתיכות קטנות של הגולגולת עד שהמוח ניתן להסיר בקלות. פוסט לתקן את המוח 2 שעות 4 מעלות צלזיוס PFA. לשטוף 3 פעמים 10 דקות PBS.
- מיד לחתוך את המוח רוחבי (50 חלקים עבים מיקרומטר) בקרח מקורר PBS באמצעות vibratome. בעזרת מברשת עדינה, העברת חלקים נבחרים immunocytochemistry לתוך בקבוקון זכוכית המכיל PBS. אחסן את החלקים הנותרים ב -20 מעלות צלזיוס cryoprotectant (30% אתילן גליקול גליצרול ו 30% ב-PBS) עד מספר שנים.
2. טרום הטבעה immunocytochemistry
- עבור immunocytochemistry, קטעים מעובדים בחופשיות צף צלוחיות זכוכית. לאורך כל ההליך, צריך להיזהר לתת חלקים להתייבש.
- ראשית, להסיר את PBS בעזרת פיפטה העברה מיד להחליף עם פתרון חדש של borohydride נתרן 0.1% ב PBS במשך 30 דקות ב RT.
- לשטוף חלקים עם PBS 3 פעמים 10 דקות, להסיר את כל הבועות, ו דגירה עבור 2 שעות RT בפתרון חסימת PBS המכיל 0.5% לטין בסרום נורמלי 5% של החיה שבה נוגדנים משני שנוצר (נסיוב עז נורמלית הדוגמה הנוכחית immunostaining-Iba1).
- דגירה של 48 שעות עם נוגדן ראשוני חסימת פתרון. עבור immunostaining-Iba1, להשתמש אנטי Iba1 ארנבת הנוגדן (1:1000).
- לשטוף חלקים עם PBS 3 פעמים 10 דקות דגירה של נוגדנים משני מצומדות כדי ביוטין (1:1000) בחסימת פתרון 2 שעות RT.
עבור immunostaining-Iba1, השתמש נגד ארנב IgGs עז. - לשטוף חלקים עם PBS 3 פעמים 10 דקות דגירה של peroxidase-streptavidin חזרת (1:1000) בחסימת פתרון לשעה 1 ב RT.
- לשטוף חלקים עם PBS 10 דקות עם טריס / HCl שנאגרו מלוחים (TBS, 50 מ"מ, ה-pH 7.4) 2 פעמים 10 דקות. כדי לחשוף את התיוג, דגירה קטעים עם DAB 0.05% ו 0.01% חמצן ב TBS (פתרון מוכן טרי). כאשר מכתים הוא חום כהה (ראה דוגמה באיור 1), לעצור את התגובה על ידי שטיפה ב TBS. בכל מקרה, בסוף התגובה לאחר למקסימום של 5 דקות. לשטוף חלקים עם כפות 10 דקות עם PB 2 פעמים 10 דקות.
3. עיבוד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים
- העברת חלקים לתוך PB בצלחת תרבות multiwell בעזרת מברשת בסדר. הכן 1% tetroxide אוסמיום פתרון PB מתחת למכסה המנוע רותח. הסר PB מבארות הצלחת תרבות להפיץ את הסעיפים שטוח עם מברשת עדינה. סעיפים לטבול מיד אוסמיום 1% למשך 30 דקות ב RT.
- העברת חלקים לתוך צלוחיות זכוכית, לשטוף עם PB 3 פעמים 10 דקות, מייבשים דרך התעמקות 2 דקות לתוך עולה ריכוזי אתנול: 2 פעמים 35%, 1 בכל פעם של 50%, 70%, 80%, 90% ו 95 %, 3 פעמים 100%, ואחריו 3 פעמים פרופילן אוקסיד.
- כדי להכין את שרף Durcupan, לשלב 20 גרם של רכיב, 20 גרם של רכיב ב ', 0.6 גרם של רכיב C, ו - 0.4 גרם של מרכיב D לכוס חד פעמיות, ומערבבים היטב עד שהצבע הופך אחיד, ויוצקים לתוך אלומיניום לשקול צלחת. במידת הצורך, אבני שרף יכול להיות מוכן על ידי שפיכת שרף לתוך הטבעת תבניות תנור ריפוי ב 55 מעלות צלזיוס במשך 48-72 שעות.
- בעזרת מברשת בסדר לשטוף עם פרופילן אוקסיד, להסיר קטעים מתוך תחמוצת פרופילן לטבול לתוך שרף Durcupan הספגה עבור לילה בבית RT.
- למחרת, לשים האלומיניום לשקול מאכל לתוך תנור 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לרכך את שרף. בעזרת מברשת שטפה עם פרופילן אוקסיד, מעיל סרט הטבעה ACLAR בשכבה דקה של שרף, שכב הסעיפים, מכסים עם סרט אחר הטבעה, ובאופן שווה להפיץ משקולות קלות (כ -2 גרם, למשל את פקקי פלסטיק של צלוחיות זכוכית) על גבי לעזור שרף מתפשטת. עבור פילמור שרף, דגירה בתנור למשך 48-72 שעות (ב 55 ° C).
- לאחר פילמור, להסיר את המשקולות אור הסרט הטבעה על החלק העליון של הסעיפים. תחת מיקרוסקופ המשקפת, בחר תחומי עניין מרובע (כ 2x2 מ"מ) ובלו אותם בקפידה מתוך הסרט באמצעות סכין גילוח.
- דבק תחומי עניין בקצה גושי שרף באמצעות דבק מגע מרפא את התנור ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- לקראת חתך, חתוך את גוש שרף בצורת טרפז שווה שוקיים עם סכין גילוח.
- שימוש ultramicrotome וסכין זכוכית, להסיר את דבק שרף על פני השטח של הרקמה. ממלאים את הסירה של סכין זכוכית עם מים מזוקקים כפול לחתוך כמה חצי דקה חלקים (0.5-1 מיקרומטר עבה).
- העברת חלקים לשקופית SuperFrost עם לולאה מושלמת. יבש את החלקים על ידי הצבת את השקופית על צלחת חימום על 80 מעלות צלזיוס למשך דקה 1. מכסים עם כמה טיפות של 0.1% toluidine כחול (borate 2 גרם נתרן ו -0.2 גרם toluidine כחול במים מזוקקים 200 מ"ל כפול) כתם במשך דקה 1. יש לשטוף את הכתם עם עודף מים מזוקקים כפול. בחינת הסעיפים עם מיקרוסקופ אור יאפשר להבחין בין רקמה צבעונית של שרף (איור 2).
- קורות חיים חיתוך עד הגבול בין רקמות שרף מגיע באמצע הקטעים. שים לב כי ההליך הבא דורש הכשרה. החלף את הסכין בכוס עם סכין יהלום ולמלא את הסירה במים מזוקקים כפול. גזור כסף כסף זהב סעיפים Ultrathin (60-80 ננומטר עבה) בזהירות לאסוף אותם על רשת רשתות נחושת באמצעות פינצטה הפוכה בסדר. יבש את רשתות על נייר הסינון.
- כדי לשפר לעומת זאת, בסעיפים Ultrathin יכול להיות מוכתם להוביל ציטראט (citrate 0.03 גרם עופרת 0.1 מ"ל נתרן הידרוקסיד 10N במים מזוקקים 10 מ"ל כפול 1). בעזרת פינצטה הפוכה בסדר, העברת רשת ירידה של ציטרט להוביל במשך 2 דקות. הסר את הרשת בעדינות ולשטוף ב 3 אמבטיות רצופים של מים מזוקקים כפול. לבסוף, לייבש את רשתות על נייר לסנן ולאחסן אותם בתוך קופסת רשת עד בדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים (איורים 3-6).
4. נציג תוצאות
באיור 1. Iba1 מוכתם בסעיף ברמה המיקרוסקופית אור. הפצה הסלולר של Iba1 מוגבל microglia, אשר מציג את הספציפיות של immunostaining. בר סולם = 100 מיקרומטר.
2. איור Toluidine כחול מוכתם חצי דקה בסעיף ברמה המיקרוסקופית אור. הערה הגבול בין רקמות שרף שבו immunostaining יופיע אינטנסיבי ביותר מיקרוסקופ אלקטרונים.
3. איור Ultrathin סעיף מראה Iba1-immunopositive perikaryon microglial ותהליכים ברמה מיקרוסקופית אלקטרונים. אלמנטים מבניים Iba1 חיובי מוכרים על ידי המשקע אימונו-DAB אלקטרונים צפופה שלהם. בר סולם = 2 מיקרומטר.
4. איור Ultrathin סעיף הצגת Iba1-immunopositive תהליכים microglial גדלים וצורות שונים ברמה מיקרוסקופית אלקטרונים. בר סולם = 2 מיקרומטר.
ה 5 "/>
איור 5. סעיף Ultrathin מראה בהגדלה גבוהה תהליך Iba1 חיובי microglial מ איור 4, המאפשר זיהוי של אברונים תאיים שלה. בר סולם = 1 מיקרומטר.
איור 6. Ultrathin סעיף חושף בהגדלה גבוהה יותר את היחסים בין ultrastructural Iba1 תהליך חיובי microglial אלמנטים הסמוך neuropil כולל סינפסות. בר סולם = 1μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן יש לנו תיאר פרוטוקול להכנת רקמת המוח העכבר עבור מיקרוסקופיה immunoelectron המספק פשרה מצוינת בין שימור ultrastructural אופטימלית זיהוי immunocytochemical, כאשר הנהלים מבוצעים בקפדנות.
בשילוב עם TEM, שיטה זו מאפשרת להבחין בין אלמנטים הסלולר עם מאפיינים בולטים כמה קריטריונים זיהוי. בפרט, מכתים אימונו-DAB של Iba1 מאפשר לזהות perikarya microglial ותהליכים, בתוך neuropil, כמו גם לנתח מורפולוגיה שלהם, אברונים תאיים, ומערכות יחסים ultrastructural עם אלמנטים סלולריים אחרים (איורים 3-6). בנוסף, הפרוטוקול הזה מאפשר לנתח את המיקומים ultrastructural של חלבונים מסיסים או קרום כרוכים אלמנטים גליה או נוירונים, כמו גם הקשר שלהם עם אברונים תאיים. ואכן, בפרוטוקול זה עם נוגדנים ספציפיים, יש לנו חשף בעבר את לוקליזציה ultrastructural של 5-5-HT1A ו HT1B קולטנים serotonergic ב perikarya, דנדריטים עצביים, הקוצים הדנדריטים, האקסונים unmyelinated, ותאי האנדותל של מבוגר עכברוש raphe dorsalis גרעין, substantia nigra, pallidus גלובוס, ו 2 בהיפוקמפוס. הראינו גם לוקליזציה ultrastructural של EphA4 ו EphB2 קולטנים טירוזין קינאז ב clathrin מצופה שלפוחית אלמנטים astrocytic ו עצביים שונים העכבר ההיפוקמפוס חולדה קליפת המוח, במהלך ההתפתחות לאחר הלידה והבגרות 3,4,5,6. לבסוף, פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם טרום הטבעה immunogold לנתח את יחסי הגומלין בין שני חלבונים ultrastructural שכותרתו בו זמנית, למשל שיתוף לוקליזציה של טרנספורטר Vglut1 glutamatergic ו EphA4 קולטן מסופי האקסון של עכבר בוגר קליפת המוח 6. לכן, הטכניקה הזו יכול להיות מיושם בהצלחה, לבד או בשילוב עם תיוג immunogold, לניתוח ultrastructural של חלבונים שונים בתוך אזורים שונים ועל סוגי תאים של מערכת העצבים המרכזית, לאורך כל החיים לאחר הלידה, בריאות ומחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים שאו-Ming Lu ו האריס א גלברד לשימוש משאבה vibratome peristaltic ו, כמו גם קארן ל בנטלי וגייל שניידר במתקן Core מיקרוסקופ אלקטרונים מחקר של אוניברסיטת רוצ'סטר המרכז הרפואי לקבלת סיוע טכני. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מ-NIH (EY019277), וייטהול Foundation, קרן Wellcome בורוז, ואת פ אלפרד סלואן קרן אל AKM. M.-È.T. ממומנת על ידי דה Fonds en la משוכלל ונדיר סנטה קוויבק (FRSQ) בפרס אימון דוקטורט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | OVATION Pharmaceuticals | ||
| Filter paper 315 24 cm | VWR international | 28331-081 | |
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich | 01680 | |
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich | 452173 | |
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich | 82325 | |
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher Scientific | 01-291-10 | |
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher Scientific | NC9261784 | |
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | |
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Gelatin subbed slides | VWR international | 100241-864 | |
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Capsule mold | Electron Microscopy Sciences | 70150 | |
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | |
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | |
| Superfrost slides | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | ||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich | G7765 | |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly. |
|||
References
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
