Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll für transcardiac Perfusion von Mäusen, die Entfernung und Schnitte des Gehirns sowie Immunperoxidasefärbung, Harz eingebettet, und ultradünne Schnitte des Gehirns Abschnitten. Nach Abschluss dieser Verfahren ist die immungefärbt Material bereit zur Untersuchung mit der Transmissionselektronenmikroskopie.

Abstract

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist äußerst nützlich für die Visualisierung von Mikrogliazellen, oligodendrocytic, Astrozyten und Neuronen subzellulären Kompartimenten (Dendriten, dendritischen Dorn, Axon, Axonterminal, Perikaryon), sowie deren intrazellulären Organellen und Zytoskelett, in das zentrale Nervensystem an hoher räumlicher Auflösung. Kombiniert mit TEM ermöglicht Pre-Embedding Immunzytochemie die Diskriminierung von zellulären Elemente mit wenigen Besonderheiten und Identifikation Kriterien (zB Mikroglia Perikarya und Prozesse, bei Verwendung eines Antikörpers gegen die Mikroglia-Marker Iba1 (ionisiertes Kalzium bindenden Adapter molecule 1; wie dargestellt hier)), die Identifizierung des Neurotransmitters Inhalte der zellulären Elemente (zB Serotonin) und deren ultrastrukturelle Lokalisierung von löslichen oder Membran-gebundenen Proteine ​​(zB 5 HT1A und EphA4-Rezeptoren). Hier beschreiben wir ein Protokoll für transcardiac Perfusion von Mäusen mit Acrolein Fixativ, das Entfernen und Schneiden des Gehirns sowie Immunperoxidase-Diaminobenzidin (DAB)-Färbung, Harz eingebettet, und ultradünne Schnitte der Hirnschnitten. Nach Abschluss dieser Verfahren ist die immungefärbt Material bereit zur Untersuchung mit TEM. Wenn konsequent durchgeführt wird, bietet diese Technik einen hervorragenden Kompromiss zwischen optimaler ultrastrukturelle Konservierung und immunzytochemische Detektion.

Protocol

1. Tierische Perfusion

1. Am Tag vor der Perfusion, vorzubereiten:
   - 2 L Phosphatpuffer (PB; 100 mM, pH 7,4) und 1 L Natrium Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, 0,9% NaCl in 50 mM PB, pH 7,4) in doppelt destilliertem Wasser. Bewahren Sie die PBS und 1L PB bei 4 ° C. Diese werden für die Perfusion und Pre-Embedding Immunzytochemie verwendet werden.
   - 1L von 4,0% Paraformaldehyd (PFA, pH 7,4) Fixierlösung, die die Durchblutung von 6 Mäusen ermöglichen. Zu diesem Zweck aufheizen 1 L PB unter einem Abzug. Wiegen Sie 40 g körniger Paraformaldehyd (PFA) abgemessen und in den PB-Lösung, wenn es 60 ° C erreicht Wenn die Lösung klar ist, mit dem PFA vollständig gelöst, auf Raumtemperatur abkühlen (RT) und bei 4 ° C.
2. Am Tag der Perfusion, vorzubereiten 500 ml 3,5% Acrolein Lösung in PB unter einem Abzug. Dann filtern Sie die 3,5% Acrolein und 4,0% PFA-Lösungen mit Filterpapier.
3. Für Maus Anästhesie, injizieren Natrium-Pentobarbital (80 mg / kg) in die Bauchhöhle mit einer 27 G ½ "-Nadel.
4. Während der Perfusion, 50 ml PBS, werden mit 75 ml Acrolein, und 150 ml PFA nacheinander in der Maus Zirkulation passieren. Zum Einrichten der Schlauchpumpe, füllen Sie den Schlauch mit PBS und fixieren ein 23 gauge ¾ "Butterfly-Nadel an einem Ende. Tauchen Sie das andere Ende des Schlauches in die Perfusionslösung (PBS, Acrolein oder PFA). Stellen Sie die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe auf 20-25 ml / min für jugendliche und erwachsene Mäuse. Während der Perfusion, sorgfältig vermeiden Luftblasen bilden, in den Schlauch.
5. Warten Sie, bis die Narkose Maus reagiert nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie ein Schwanz kneifen, bevor Sie fortfahren. Legen Sie das Tier in einer Dissektion Fach und befestigen Sie die Pfoten mit Klebeband. Mit Pinzette und Schere, öffnen die Haut und Brustkorb in das Herz aussetzen. Zur Minimierung Hirnischämie, muss die Durchblutung zu schnell gestartet werden. Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer kleinen Schere und starten Sie die Schlauchpumpe. Halten Sie die Herzen mit einer Pinzette, legen Sie die Butterfly-Nadel in die Spitze des linken Ventrikels.
6. Beim Wechsel Lösung, stoppen Sie die Schlauchpumpe, überweisen Sie den Schlauch von einer Lösung zur anderen, und starten Sie die Pumpe sofort.
7. Wenn 150 ml PFA abgelaufen ist, stoppen die Schlauchpumpe. Mit einer kleinen Schere, schnitt den Kopf, öffnen Sie die Haut, und brechen den Schädel zwischen den Augen. Mit Hilfe von kleinen Pinzette vorsichtig Chip in kleine Stücke des Schädels, bis das Gehirn leicht entfernt werden kann. Post-fix das Gehirn für 2 Stunden bei 4 ° C in PFA. Wash 3 mal 10 Minuten in PBS.
8. Unmittelbar schneiden das Gehirn in Querrichtung (50 um dicke Schnitte) in eisgekühltem PBS mit einem Vibratom. Mit einem feinen Pinsel, Transfer Abschnitte für Immunzytochemie in einen Glaskolben mit PBS ausgewählt. Bewahren Sie die restlichen Abschnitte bei -20 ° C in Gefrierschutzmittel (30% Ethylenglykol und 30% Glycerin in PBS) für bis zu mehreren Jahren.

2. Pre-Embedding Immunzytochemie

1. Für Immunzytochemie, sind Abschnitte verarbeitet frei schwebend in Glasflaschen. Während des gesamten Verfahrens muss man sorgfältig vermeiden, dass Teile austrocknen.
2. Entfernen Sie zuerst den PBS mit einem Transferpipette und sofort mit einer frischen Lösung von 0,1% Natriumborhydrid in PBS für 30 Minuten bei RT zu ersetzen.
3. Spülen Sie Abschnitte mit PBS 3 mal 10 Minuten, die Beseitigung aller Blasen, und inkubieren für 2 Stunden bei RT in einer Blockierungslösung PBS mit 0,5% Gelatine und 5% normalem Serum des Tieres, in dem der sekundäre Antikörper erzeugt wurde (normal Ziegenserum in im vorliegenden Beispiel von Iba1-Immunfärbung).
4. 48 Stunden lang mit dem primären Antikörper in Blockierungslösung. Für Iba1-Immunfärbung, verwenden Kaninchen-Anti-Iba1 Antikörper (1:1000).
5. Spülen Sie Abschnitte mit PBS 3 mal 10 Minuten und inkubieren in Sekundär-Antikörper, konjugiert mit Biotin (1:1000) in Blocking-Lösung für 2 Stunden bei RT.
   Für Iba1-Immunfärbung, verwenden Ziege Anti-Kaninchen-IgG.
6. Spülen Sie Abschnitte mit PBS 3 mal 10 Minuten und inkubieren in Streptavidin-Meerrettichperoxidase (1:1000) in Blocking-Lösung für 1 Stunde bei RT.
7. Spülen Sie Abschnitte mit PBS 10 Minuten und mit Tris / HCl-gepufferte Kochsalzlösung (TBS, 50 mM, pH 7,4) 2 mal 10 Minuten. Zu offenbaren, die Etikettierung und inkubieren Abschnitte mit 0,05% DAB und 0,01% Wasserstoffperoxid in TBS (Lösung frisch zubereitet). Wenn die Färbung dunkelbraun (siehe Beispiel in Abbildung 1) ist, stoppen Sie die Reaktion durch Spülen in TBS. In jedem Fall Ende der Reaktion nach maximal 5 Minuten. Spülen Sie Abschnitte mit TBS 10 Minuten und mit PB 2 mal 10 Minuten.

3. Verarbeitung für die Elektronenmikroskopie

1. Transfer-Abschnitte in PB in einer Multiwell Kultur Platte mit einem feinen Pinsel. Bereiten Sie 1% Osmiumtetroxid-Lösung in PB unter einem rauchender Haube. Entfernen PB aus den Vertiefungen der Kulturschale und Verbreitung der Abschnitte Wohnung mit einem feinen Pinsel. Sofort tauchen Abschnitte in 1% Osmium für 30 Minuten bei RT.
2. Übertragen Sie die Abschnitte in Glasflaschen, mit PB 3 mal 10 Minuten spülen und austrocknen durch 2 Minuten Eintauchen in aufsteigender Konzentrationen von Ethanol: 2 mal 35%, 1 Mal je 50%, 70%, 80%, 90%, und 95 %, 3 mal 100%, von 3-mal Propylenoxid gefolgt.
3. Zur Vorbereitung der Durcupan Harz, kombiniert 20 g der Komponente A, mix 20 g der Komponente B, 0,6 g der Komponente C, und 0,4 g der Komponente D in eine Einweg-Becher, gut, bis die Farbe wird gleichmäßiger, und gießen Sie in ein Aluminium-wiegen Gericht. Bei Bedarf können Harzblöcke durch Gießen Harz in Einbettformen und Aushärtung in einem 55 ° C im Ofen für 48-72 Stunden hergestellt werden.
4. Mit einem feinen Pinsel mit Propylenoxid gespült, entfernen Sie die Abschnitte aus dem Propylenoxid und tauchen Sie ein in die Durcupan Harz zur Imprägnierung über Nacht bei RT.
5. Am folgenden Tag legte der Aluminium wiegt Gericht in einem 55 ° C im Ofen für 10 Minuten, um das Harz zu erweichen. Mit einem Pinsel mit Propylenoxid, Beschichtung eines ACLAR Einbettung Film mit einer dünnen Schicht von Harz gespült, legen die Abschnitte, Deckel mit einem anderen Einbettung Film und gleichmäßig zu verteilen leichten Gewichten (ca. 2 g, zum Beispiel die Plastikkappen der Glasfläschchen) auf, um Harz zu verbreiten. Für Harz Polymerisation in den Ofen für 48-72 Stunden (bei 55 ° C) inkubieren.
6. Nach der Polymerisation, entfernen Sie den leichten Gewichten und Einbettung Folie auf der Oberseite der Abschnitte. Unter einem Binokular, wählen quadratische Bereiche von Interesse (ca. 2x2 mm) und vorsichtig Verbrauchsteuern sie aus dem Film mit einer Rasierklinge.
7. Kleben Sie die Bereiche von Interesse an der Spitze der Harz Blöcke mit Sekundenkleber und Heilung in der 55 ° C im Ofen für 1 Stunde.
8. Als Vorbereitung für das Schneiden, schneiden Sie die Harzblock die Form eines gleichschenkligen Trapez mit einer Rasierklinge.
9. Mit einem Ultramikrotom und ein Glas Messer, entfernen Sie den Kleber und Harz an der Oberfläche des Gewebes. Füllen Sie das Boot des Glases Messer mit doppelt destilliertem Wasser und schneiden Sie ein paar Semidünnschnitten (0.5-1 &mgr; m dick).
10. Übertragen Sie die Abschnitte zu einem SuperFrost Objektträger mit einer perfekten Schleife. Trocknen Sie die Teile, indem Sie die Folie auf einer Heizplatte bei 80 ° C für 1 Minute. Cover mit ein paar Tropfen von 0,1% Toluidinblau-Färbung (2 g Natrium-Borat und 0,2 g Toluidinblau in 200 ml doppelt destilliertem Wasser) für 1 Minute. Spülen Sie die überschüssige Beize mit doppelt destilliertem Wasser. Die Untersuchung der Schnitte mit einem Lichtmikroskop ermöglicht den gefärbten Gewebeschnitten aus dem Harz (Abb. 2) zu unterscheiden.
11. Fortsetzen Schneiden, bis die Grenze zwischen Gewebe und Harz bis zur Mitte der Abschnitte. Beachten Sie, dass die folgende Prozedur Training erfordert. Ersetzen Sie das Glas Messer mit einer Diamant-Messer und füllen das Boot mit doppelt destilliertem Wasser. Cut Silber zu Silber-Gold-Ultradünnschnitte (60-80 nm dick) und sorgfältig sammeln sie auf Kupfer Maschengitter mit feinen Pinzetten invertiert. Trocknen Sie die Gitter auf ein Filterpapier.
12. Zur Verbesserung Gegensatz dazu können ultradünne Schnitte mit Bleicitrat (0,03 g Bleicitrat und 0,1 mL 10 N Natronlauge in 10 mL doppelt destilliertem Wasser ¹⁾ angefärbt werden. Mit feinen Pinzette invertiert, Transfer ein Gitter zu einem Rückgang der Bleicitrat für 2 Minuten. Entfernen Sie das Gitter und zart in 3 aufeinanderfolgenden Bädern doppelt destilliertem Wasser zu spülen. Schließlich trocknen die Gitter auf ein Filterpapier und speichert sie in einer Gitterbox bis elektronenmikroskopische Untersuchung (Abbildungen 3-6).

4. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Iba1-gefärbte Sektion an der Ampel mikroskopischer Ebene. Die zelluläre Verteilung von Iba1 ist Mikroglia, die die Spezifität der Immunfärbung zeigt beschränkt. Maßstab = 100 um.

Abbildung 2. Toluidinblau-gefärbten semi-Dünnschliff an der Ampel mikroskopischer Ebene. Beachten Sie die Grenze zwischen Gewebe und Harz, wo die Immunfärbung erscheinen intensivsten wird am Elektronenmikroskop.

Abbildung 3. Ultradünnschnitt zeigt Iba1-immunpositive Mikroglia Perikaryon und Prozesse bei der elektronenmikroskopischen Ebene. Iba1-positive strukturelle Elemente sind durch ihre Immunperoxidase-DAB Elektronen-dichten Niederschlag erkannt. Maßstab = 2 um.

Abbildung 4. Ultradünnschnitt Anzeige Iba1-immunpositive Mikroglia Prozesse der verschiedenen Größen und Formen bei der elektronenmikroskopischen Ebene. Maßstab = 2 um.

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Abbildung 5. Ultradünnschnitt zeigt bei stärkerer Vergrößerung ein Iba1-positive Mikroglia Prozess von Abbildung 4, welche die Identifizierung der intrazellulären Organellen. Maßstab = 1 um.

Abbildung 6. Ultradünnschnitt enthüllt bei höherer Vergrößerung die ultrastrukturelle Beziehungen zwischen einem Iba1-positive Mikroglia-Prozess und in der Nähe Elemente Neuropil einschließlich Synapsen. Balken = 1 &mgr;.

Discussion

Hier haben wir ein Protokoll für die Herstellung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie, dass er einen ausgezeichneten Kompromiss zwischen optimaler ultrastrukturelle Konservierung und immunzytochemische Nachweis, wenn die Verfahren konsequent durchgeführt liefert beschrieben.

Kombiniert mit TEM ermöglicht diese Methode, um zelluläre Elemente mit wenigen Besonderheiten und Identifikation Kriterien zu unterscheiden. Insbesondere ermöglicht die Immunperoxidase-DAB-Färbung von Iba1 zu Mikroglia Perikarya und Prozesse zu identifizieren, innerhalb des Neuropil, sowie auf ihre Morphologie, intrazellulären Organellen und ultrastrukturelle Beziehungen mit anderen zellulären Elementen (Abbildungen 3-6) zu analysieren. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll Analyse der ultrastrukturellen Standorten von löslichen oder Membran-gebundenen Proteine ​​in Glia-oder Nervenzellen Elemente sowie ihre Assoziation mit intrazellulären Organellen. In der Tat, die dieses Protokoll verwenden mit spezifischen Antikörpern, haben wir zuvor die ultrastrukturelle Lokalisation von 5-HT 1A und 5-HT 1B serotonergen Rezeptoren in der neuronalen Perikarya, Dendriten, dendritische Dornen, marklosen Axonen und Endothelzellen der erwachsenen Ratte Raphe dorsalis Kern, Substantia enthüllt nigra, Globus pallidus und Hippocampus ^2. Wir haben auch die ultrastrukturellen Lokalisation von EphA4 und EphB2 Tyrosinkinase-Rezeptoren in Clathrin-coated Vesikeln und anderen astrozytären und neuronalen Elemente in Maus und Ratte Hippocampus und der Großhirnrinde dargestellt, während der postnatalen Entwicklung und im Erwachsenenalter ^3,4,5,6. Schließlich kann dieses Protokoll mit Pre-Embedding Immunogold die ultrastrukturelle Beziehungen zwischen zwei gleichzeitig markierten Proteine ​​zu analysieren, zum Beispiel die Co-Lokalisation von glutamatergen VGLUT1 Transporter und EphA4 Rezeptor in Axonterminalen der erwachsenen Maus Großhirnrinde ⁶ kombiniert werden. Daher kann diese Technik erfolgreich angewendet werden, allein oder in Kombination mit Immunogoldmarkierung, für die ultrastrukturelle Analyse der verschiedenen Proteine ​​in den verschiedenen Regionen und Zelltypen des zentralen Nervensystems, während die postnatale Leben in Gesundheit und Krankheit.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium pentobarbital (Nembutal)	OVATION Pharmaceuticals
Filter paper 315 24 cm	VWR international	28331-081
*Acrolein purum (≥95%)	Sigma-Aldrich	01680
Sodium borohydride (≥98%)	Sigma-Aldrich	452173
*Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%)	Sigma-Aldrich	441244
Normal goat serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Rabbit anti-Iba1 primary antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	019-19741	Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific	Jackson ImmunoResearch	111-066-046	Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Peroxidase-conjugated streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-030-084	Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
*Osmium tetroxide 4% solution	Electron Microscopy Sciences	19150	Light sensitive
Propylene oxide (≥99%)	Sigma-Aldrich	82325
Polypropylene disposable beakers (50 mL)	Fisher Scientific	01-291-10
Aluminium weigh dishes (70 mm)	Fisher Scientific	NC9261784
Durcupan epoxy resin	Electron Microscopy Sciences	14040
Embedding mold	Electron Microscopy Sciences	70907
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	44581
Gelatin subbed slides	VWR international	100241-864
ACLAR embedding films (7.8 mm)	Electron Microscopy Sciences	50425
Capsule mold	Electron Microscopy Sciences	70150
High-performance super glue	Corporate Express	LOC30379
Perfect loop for ultra thin sections	Electron Microscopy Sciences	70944
Superfrost slides	Fisher Scientific	22-178-277
Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm)	Diatome
Gelatin from cold water fish skin (~45%)	Sigma-Aldrich	G7765
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.