إعداد عينة ل Metabolomics: طريقة لإعداد عينات الخلية للتنميط المستقلب

Overview

يصف هذا الفيديو تقنية إعداد عينات خلايا سرطان الثدي للتنميط المستقلب. يتم التعامل مع خلايا سرطان الثدي مع استراديول, الذي يرتبط مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ويسبب التغيير في تكوين المستقلب.

Protocol

1. إعداد عينة المقايسة الأيضية

1. زراعة الخلايا وعلاجها
   1. البذور 400،000 خلايا MCF7 لكل لوحة 10 سم في متوسط النمو. لكل علاج إعداد ثلاث عينات. استخدم لوحتين في كل عينة لتلقي خلايا كافية للكشف. في اليوم 3، إزالة المتوسط وإضافة 5 مل المتوسطة الطازجة مع أو بدون^10-8 M استراديول أو E2 إلى الخلايا. عالج الخلايا لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية في الغلاف الجوي المرطب 5٪ CO_2).
2. مجموعة نماذج
   1. إضافة 5 مل الجليد الباردة 1x برنامج تلفزيوني إلى لوحة، يستنشق برنامج تلفزيوني بعد إمالة لفترة وجيزة لوحة عدة مرات. كرر مرتين، وإزالة أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني بعد غسل الماضي.
   2. أضف 750 ميكرولتر من الأسيتون قبل البرد إلى كل لوحة وكشط الخلايا. الجمع بين الخلايا في الأسيتون من اثنين من لوحات في أنبوب 2 مل على الجليد.
   3. عدد الخلايا للتطبيع
      1. لكل علاج، استخدم طبقين إضافيين للقياس الكمي للخلايا. لإلغاء إرفاق الخلايا من لوحة، إضافة 2 مل من العازلة HE (1x HBSS، 10 M HEPES، 0.075٪ NaHCO_3، و 1 M EDTA) في كل لوحة واحتضان لمدة 5 دقائق.
      2. جمع وخلط جيدا الخلايا عن طريق الخلايا pipetting في العازلة HE. استخدام ما مجموعه 20 ميكرولتر حل الخلية لحساب عدد الخلية باستخدام مقياس الدم.
3. قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية قبل إرسالها إلى مركز Metabolomics لتحديد وتحديد كمية الأيض باستخدام تحليل قياس الطيف الكتلي لكروماتوغرافيا الغاز (GC-MS).