Metabolomics için Örnek Hazırlama: Metabolit Profil oluşturma için Hücre Örnekleri Hazırlama Yöntemi

Overview

Bu videoda metabolit profilleme için meme kanseri hücre örneklerini hazırlama tekniği açıklanmaktadır. Meme kanseri hücreleri, östrojen reseptör alfasına bağlanan ve metabolit bileşiminde değişime neden olan estradiol ile tedavi edilir.

Protocol

1. Metabolomics Tahlil Numune Hazırlama

1. Hücre Kültürü ve Tedavisi
   1. Büyüme ortamında 10 cm plaka başına 400.000 MCF7 hücresi tohumu. Her tedavi için üç örnek hazırlayın. Algılama için yeterli hücre almak için her örnekte iki plaka kullanın. 3. günde, ortamı çıkarın ve hücrelere 10^-8 M Estradiol veya E2 olsun veya olmayın 5 ml taze ortam ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca tedavi edin (nemlendirilmiş% 5 CO₂ atmosferinde 37 °C).
2. Örnek Toplama
   1. Plakaya 5 ml buz gibi soğuk 1x PBS ekleyin, plakayı birkaç kez kısa bir süre eğdikten sonra PBS'yi aspire edin. İki kez tekrarlayın ve son yıkamadan sonra mümkün olduğunca çok PBS çıkarın.
   2. Her tabağa 750 μl soğuk öncesi aseton ekleyin ve hücreleri kazıyın. Asetondaki hücreleri iki plakadan buz üzerinde 2 ml'lik bir tüpte birleştirin.
   3. Normalleştirme için hücre sayısı
      1. Her tedavi için hücre nicelemesi için iki ekstra plaka kullanın. Hücreleri plakadan çıkarmak için, her plakaya 2 ml HE tamponu (1x HBSS, 10 mM HEPES, % 0.075 NaHCO₃ ve 1 mM EDTA) ekleyin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      2. HE tamponundaki hücreleri pipetleme ile hücreleri iyice toplayın ve karıştırın. Hemositometre kullanarak hücre numarasını saymak için toplam 20 μl hücre çözeltisi kullanın.
3. Gaz kromatografisi kütle spektrometresi (GC-MS) analizini kullanarak metabolitleri tanımlamak ve ölçmek için Metabolomics merkezine göndermeden önce örnekleri -80 °C'de saklayın.