Overview
Denna video beskriver en teknik för att förbereda bröstcancer cell prover för metabolit profilering. Bröstcancerceller behandlas med estradiol, som binder till östrogenreceptorn alfa och orsakar förändring i metabolitsammansättningen.
Protocol
1. Metabolomisk analysprovberedning
- Cellkultur och behandling
- Frö 400 000 MCF7-celler per 10 cm platta i tillväxtmedium. För varje behandling bered tre prover. Använd två plattor i varje prov för att ta emot tillräckligt med celler för detektion. På dag 3, ta bort mediet och tillsätt 5 ml färskt medium med eller utan 10-8 M Estradiol eller E2 till cellerna. Behandla cellerna i 24 timmar (37 °C i fuktad 5% CO2-atmosfär).
- Exempelsamling
- Tillsätt 5 ml iskall 1x PBS på plattan, aspirera PBS efter att kort ha lutat plattan flera gånger. Upprepa två gånger och ta bort så mycket PBS som möjligt efter den sista tvätten.
- Tillsätt 750 μl förkyld aceton på varje tallrik och skrapa cellerna. Kombinera cellerna i aceton från två plattor till ett 2 ml rör på is.
- Cellantal för normalisering
- För varje behandling, använd två extra plattor för cellk kvantifiering. För att avfästa cellerna från plattan, tillsätt 2 ml HE-buffert (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO3 och 1 mM EDTA) i varje platta och inkubera i 5 min.
- Samla in och blanda cellerna väl genom att pipetting celler i HE-bufferten. Använd totalt 20 μl celllösning för att räkna cellnumret med hjälp av en hemocytometer.
- Förvara proverna vid -80 °C innan du skickar till metabolomikcentret för att identifiera och kvantifiera metaboliterna med hjälp av gaskromatografimasspektrometrianalys (GC-MS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.