Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Provberedning för metabolomik: En metod för att förbereda cellprover för metabolitprofilering

Overview

Denna video beskriver en teknik för att förbereda bröstcancer cell prover för metabolit profilering. Bröstcancerceller behandlas med estradiol, som binder till östrogenreceptorn alfa och orsakar förändring i metabolitsammansättningen.

Protocol

1. Metabolomisk analysprovberedning

  1. Cellkultur och behandling
    1. Frö 400 000 MCF7-celler per 10 cm platta i tillväxtmedium. För varje behandling bered tre prover. Använd två plattor i varje prov för att ta emot tillräckligt med celler för detektion. På dag 3, ta bort mediet och tillsätt 5 ml färskt medium med eller utan 10-8 M Estradiol eller E2 till cellerna. Behandla cellerna i 24 timmar (37 °C i fuktad 5% CO2-atmosfär).
  2. Exempelsamling
    1. Tillsätt 5 ml iskall 1x PBS på plattan, aspirera PBS efter att kort ha lutat plattan flera gånger. Upprepa två gånger och ta bort så mycket PBS som möjligt efter den sista tvätten.
    2. Tillsätt 750 μl förkyld aceton på varje tallrik och skrapa cellerna. Kombinera cellerna i aceton från två plattor till ett 2 ml rör på is.
    3. Cellantal för normalisering
      1. För varje behandling, använd två extra plattor för cellk kvantifiering. För att avfästa cellerna från plattan, tillsätt 2 ml HE-buffert (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO3 och 1 mM EDTA) i varje platta och inkubera i 5 min.
      2. Samla in och blanda cellerna väl genom att pipetting celler i HE-bufferten. Använd totalt 20 μl celllösning för att räkna cellnumret med hjälp av en hemocytometer.
  3. Förvara proverna vid -80 °C innan du skickar till metabolomikcentret för att identifiera och kvantifiera metaboliterna med hjälp av gaskromatografimasspektrometrianalys (GC-MS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Tags

Tomt värde ärende
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter