Overview
Denne videoen beskriver en teknikk for å forberede brystkreftcelleprøver for metabolittprofilering. Brystkreftceller behandles med østradiol, som binder seg til østrogenreseptor alfa og forårsaker endring i metabolittsammensetningen.
Protocol
1. Metabolomics Analyse Prøvepreparering
- Cellekultur og behandling
- Frø 400.000 MCF7 celler per 10 cm plate i vekstmedium. For hver behandling forberede tre prøver. Bruk to plater i hvert utvalg for å få nok celler til søket. På dag 3, fjern mediet og tilsett 5 ml friskt medium med eller uten10-8 M Østradiol eller E2 til cellene. Behandle cellene i 24 timer (37 °C i fuktet 5 % CO2-atmosfære).
- Eksempel på samling
- Tilsett 5 ml iskald 1x PBS til platen, aspirer PBS etter kort tilting av platen flere ganger. Gjenta to ganger, og fjern så mye PBS som mulig etter siste vask.
- Tilsett 750 μl forkjølet aceton til hver plate og skrap cellene. Kombiner cellene i aceton fra to plater til et 2 ml rør på is.
- Celleantall for normalisering
- For hver behandling, bruk to ekstra plater for celle kvantifisering. For å løsne cellene fra platen, tilsett 2 ml HE-buffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO3 og 1 mM EDTA) i hver plate og inkuber i 5 minutter.
- Samle og bland cellene godt ved å pipettere celler i HE-bufferen. Bruk totalt 20 μl celleløsning for å telle cellenummeret ved hjelp av et hemocytometer.
- Oppbevar prøvene ved -80 °C før du sender dem til Metabolomics-senteret for å identifisere og kvantifisere metabolittene ved hjelp av analyse av gasskromatografimassespektrometri (GC-MS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.