Overview
这段视频描述了一种为代谢物分析准备乳腺癌细胞样本的技术。乳腺癌细胞用雌二醇治疗,雌二醇与雌激素受体α结合,导致代谢物成分发生变化。
Protocol
1. 代谢学测定样品制备
- 细胞培养与治疗
- 种子 400,000 MCF7 细胞每 10 厘米板在生长介质。每次治疗准备三个样本。在每个样本中使用两个板来接收足够的细胞进行检测。在第 3 天,取出介质,并在细胞中加入 5 毫升新鲜介质,无论有没有 10-8 M 雌二醇或 E2。将细胞处理24小时(加湿5%CO2大气中的37°C)。
- 样本收集
- 将 5 毫升冰冷 1 倍 PBS 添加到板中,在短暂倾斜板数次后吸气 PBS。重复两次,并在上次洗涤后尽可能多地删除 PBS。
- 在每个盘子中加入 750μl 的预冷血清酮,然后刮伤细胞。将两个板中的蛋酮细胞组合成冰上的2毫升管。
- 正常化的细胞计数
- 对于每次治疗,使用两个额外的板细胞定量。要从板中去附加细胞,在每个板中加入 2 毫升 HE 缓冲(1 倍 HBSS、10 m HEPES、0.075% NaHCO3和 1 mM EDTA),并孵育 5 分钟。
- 通过在 HE 缓冲区中管状细胞收集和混合好细胞。使用总共 20 μl 细胞溶液使用血细胞计计算细胞号。
- 将样品储存在 -80 °C,然后发送到代谢学中心,使用气相色谱质谱 (GC-MS) 分析识别和量化代谢物。
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