Prøveforberedelse til metabolomics: En metode til at forberede celleprøver til metabolitprofilering

Overview

Denne video beskriver en teknik til at forberede brystkræft celleprøver til metabolit profilering. Brystkræftceller behandles med østradiol, som binder sig til østrogenreceptoren alpha og forårsager ændringer i metabolittens sammensætning.

Protocol

1. Metabolomics Assay Prøve Forberedelse

1. Cellekultur og -behandling
   1. Frø 400.000 MCF7 celler pr 10 cm plade i vækstmedium. Til hver behandling forberedes tre prøver. Brug to plader i hver prøve til at modtage nok celler til detektionen. På dag 3 fjernes mediet og tilsættes 5 ml frisk medium med eller uden 10^-8 M Østradiol eller E2 til cellerne. Cellerne behandles i 24 timer (37 °C i befugtet 5% CO_{2-atmosfære).}
2. Eksempel på indsamling
   1. Der tilsættes 5 ml iskold 1x PBS til pladen, PBS efter kort at have vippet pladen flere gange. Gentag to gange, og fjern så meget PBS som muligt efter den sidste vask.
   2. Der tilsættes 750 μl forkold acetone til hver plade, og cellerne skrabes. Kombiner cellerne i acetone fra to plader i et 2 ml rør på is.
   3. Antal celler til normalisering
      1. Til hver behandling skal du bruge to ekstra plader til cellekvantificering. Cellerne fra pladen skal sættes af, tilsættes 2 ml HE-buffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO₃ og 1 mM EDTA) i hver plade og inkuberes i 5 min.
      2. Indsaml og bland cellerne godt ved at pipettere celler i HE-bufferen. Brug i alt 20 μl celleopløsning til at tælle cellenummeret ved hjælp af et hæmocytometer.
3. Prøverne opbevares ved -80 °C, før de sendes til Metabolomics-centret for at identificere og kvantificere metabolitterne ved hjælp af gaskromatografimassespektrometrianalyse (GC-MS).