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Encyclopedia of Experiments

Préparation de l’échantillon pour la métabolomique : une méthode pour préparer des échantillons cellulaires pour le profilage des métabolites

Overview

Cette vidéo décrit une technique de préparation d’échantillons de cellules cancéreuses du sein pour le profilage des métabolites. Les cellules cancéreuses du sein sont traitées avec de l’estradiol, qui se lie au récepteur alpha des œstrogènes et provoque un changement dans la composition des métabolites.

Protocol

1. Préparation de l’échantillon d’analyse métabolomique

  1. Culture cellulaire et traitement
    1. Graine 400 000 cellules MCF7 par plaque de 10 cm en milieu de croissance. Pour chaque traitement préparer trois échantillons. Utilisez deux plaques dans chaque échantillon pour recevoir suffisamment de cellules pour la détection. Le jour 3, retirer le milieu et ajouter 5 ml de milieu frais avec ou sans 10-8 M Estradiol ou E2 aux cellules. Traiter les cellules pendant 24 heures (37 °C dans l’atmosphère humidifiée de 5 % de CO2).
  2. Collection d’échantillons
    1. Ajouter 5 ml de glace froide 1x PBS à la plaque, aspirer le PBS après avoir brièvement incliné la plaque à plusieurs reprises. Répétez deux fois et retirez autant de PBS que possible après le dernier lavage.
    2. Ajouter 750 μl d’acétone pré-froid à chaque assiette et gratter les cellules. Mélanger les cellules en acétone à partir de deux plaques dans un tube de 2 ml sur la glace.
    3. Nombre de cellules pour la normalisation
      1. Pour chaque traitement, utilisez deux plaques supplémentaires pour la quantification cellulaire. Pour dé-fixer les cellules de la plaque, ajouter 2 ml de tampon HE (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO3, et 1 mM EDTA) dans chaque plaque et incuber pendant 5 min.
      2. Recueillir et bien mélanger les cellules par des cellules pipetting dans le tampon HE. Utilisez une solution cellulaire totale de 20 μl pour compter le numéro de cellule à l’aide d’un hémocytomètre.
  3. Stockez les échantillons à -80 °C avant de les envoyer au centre métabolomique pour identifier et quantifier les métabolites à l’aide de l’analyse de spectrométrie de masse chromatographie gazeuse (GC-MS).

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