Preparação da amostra para metabolômica: um método para preparar amostras celulares para perfil metabólito

Overview

Este vídeo descreve uma técnica de preparação de amostras de células cancerígenas de mama para perfil metabólito. As células cancerígenas de mama são tratadas com estradiol, que se liga ao receptor de estrogênio alfa e causa alteração na composição metabólica.

Protocol

1. Preparação da amostra de ensaio metabolômico

1. Cultura e Tratamento Celular
   1. Semente 400.000 células MCF7 por placa de 10 cm em meio de crescimento. Para cada tratamento prepare três amostras. Use duas placas em cada amostra para receber células suficientes para a detecção. No dia 3, remova o meio e adicione 5 ml de meio fresco com ou sem 10^-8 M Estradiol ou E2 às células. Trate as células por 24 horas (37 °C em atmosfera umidificada de 5% de CO_2).
2. Coleta de Amostras
   1. Adicione 5 ml de gelo frio 1x PBS à placa, aspire o PBS depois de inclinar brevemente a placa várias vezes. Repita duas vezes e remova o máximo de PBS possível após a última lavagem.
   2. Adicione 750 μl de acetona pré-fria a cada placa e raspe as células. Combine as células em acetona de duas placas em um tubo de 2 ml no gelo.
   3. Contagem celular para normalização
      1. Para cada tratamento, use duas placas extras para quantificação celular. Para desarmar as células da placa, adicione 2 ml de tampão HE (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO₃ e 1 mM EDTA) em cada placa e incubar por 5 min.
      2. Colete e misture bem as células por células tubulações no buffer HE. Use uma solução celular total de 20 μl para contar o número da célula usando um hemócito.
3. Armazene as amostras a -80 °C antes de enviar para o centro de Metabolômica para identificar e quantificar os metabólitos usando a análise de espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS).