הכנה לדוגמה עבור Metabolomics: שיטה להכנת דגימות תאים עבור פרופיל מטבוליט

Overview

וידאו זה מתאר טכניקה של הכנת דגימות תאים סרטן השד עבור פרופיל מטבוליט. תאים סרטניים בשד מטופלים עם אסטרדיול, אשר נקשר אלפא קולטן אסטרוגן וגורם לשינוי בהרכב מטבוליט.

Protocol

1. מטבולומיקס Assay הכנה לדוגמה

1. תרבות וטיפול בתאים
   1. זרע 400,000 תאי MCF7 לכל צלחת 10 ס"מ במדיום צמיחה. עבור כל טיפול להכין שלוש דגימות. השתמש בשני לוחות בכל דגימה כדי לקבל מספיק תאים לזיהוי. ביום 3, להסיר את המדיום ולהוסיף 5 מ"ל בינוני טרי עם או בלי^10-8 M אסטרדיול או E2 לתאים. לטפל בתאים במשך 24 שעות (37 °C (37 °F) באטמוספירה לחות 5% CO_2).
2. אוסף לדוגמה
   1. מוסיפים 5 מ"ל קר כקרח 1x PBS לצלחת, שואפים את PBS לאחר הטיה קצרה של הצלחת מספר פעמים. יש לחזור פעמיים ולהסיר כמה שיותר PBS לאחר הכביסה האחרונה.
   2. מוסיפים 750 μl של אצטון טרום קר לכל צלחת לגרד את התאים. לשלב את התאים אצטון משתי צלחות לתוך צינור 2 מ"ל על הקרח.
   3. ספירת תאים לנורמליזציה
      1. עבור כל טיפול, השתמש בשתי צלחות נוספות לכימות תאים. כדי לבטל את הצמדת התאים מהצלחת, להוסיף 2 מ"ל של מאגר HE (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0.075% NaHCO_3, ו 1 mM EDTA) לתוך כל צלחת דגירה במשך 5 דקות.
      2. לאסוף ולערבב היטב את התאים על ידי pipetting תאים במאגר HE. השתמש בסך הכל 20 μl פתרון התא לספור את מספר התא באמצעות hemocytometer.
3. אחסן את הדגימות ב- -80 °C (70 °F) לפני שליחת למרכז Metabolomics כדי לזהות ולכמת את המטבוליטים באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית גז (GC-MS).