Preparazione del campione per la metabolomica: un metodo per preparare campioni di cellule per la profilazione dei metaboliti

Overview

Questo video descrive una tecnica di preparazione dei campioni di cellule tumorali del seno per la profilazione dei metaboliti. Le cellule tumorali del seno sono trattate con estradiolo, che si lega al recettore degli estrogeni alfa e provoca cambiamenti nella composizione del metabolita.

Protocol

1. Preparazione del campione di saggio metabolomica

1. Coltura e trattamento cellulare
   1. Semina 400.000 cellule MCF7 per piastra da 10 cm in mezzo di crescita. Per ogni trattamento preparare tre campioni. Utilizzare due lastre in ogni campione per ricevere abbastanza cellule per il rilevamento. Il giorno 3, rimuovere il mezzo e aggiungere 5 ml di mezzo fresco con o senza^10-8 M Estradiolo o E2 alle cellule. Trattare le cellule per 24 ore (37 °C in atmosfera umidificata 5% CO_2).
2. Raccolta di esempi
   1. Aggiungere 5 ml di ghiaccio freddo 1x PBS alla piastra, aspirare il PBS dopo aver inclinato brevemente la piastra più volte. Ripetere due volte e rimuovere il più PBS possibile dopo l'ultimo lavaggio.
   2. Aggiungere 750 μl di acetone pre-freddo ad ogni piastra e raschiare le cellule. Unire le cellule in acetone da due piastre in un tubo da 2 ml su ghiaccio.
   3. Numero di celle per la normalizzazione
      1. Per ogni trattamento, utilizzare due piastre extra per la quantificazione cellulare. Per disossare le cellule dalla piastra, aggiungere 2 ml di tampone HE (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO_{3 e} 1 mM EDTA) in ogni piastra e incubare per 5 min.
      2. Raccogliere e mescolare bene le cellule pipettando le celle nel buffer HE. Utilizzare un totale di soluzione cellulare di 20 μl per contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
3. Conservare i campioni a -80 °C prima di inviarli al centro metabolomica per identificare e quantificare i metaboliti utilizzando l'analisi della spettrometria di massa gascromatografica (GC-MS).