메타볼로믹스에 대한 샘플 준비: 대사산물 프로파일링을 위한 세포 샘플을 준비하는 방법

Overview

이 비디오는 대사 산물 프로파일링을 위한 유방암 세포 견본을 준비하는 기술을 기술합니다. 유방암 세포는 에스트로겐 수용체 알파에 결합하고 대사 산물 조성물의 변화를 일으키는 estradiol로 치료됩니다.

Protocol

1. 메타볼로믹스 분석 샘플 준비

1. 세포 배양 및 치료
   1. 종자 400,000 MCF7 세포 당 10cm 플레이트 성장 배지. 각 치료에 대해 세 가지 샘플을 준비합니다. 각 샘플에 두 개의 플레이트를 사용하여 검출을 위한 충분한 셀을 수신합니다. 3일째에, 배지를 제거하고^10-8 M 에스트라디올 또는 E2의 유무에 관계없이 5ml의 신선한 배지를 세포에 추가합니다. 세포를 24시간 동안 치료한다(가습5%_CO2 대기시 37°C).
2. 샘플 수집
   1. 접시에 5 ml 얼음 차가운 1x PBS를 추가하고, 잠시 접시를 여러 번 기울인 후 PBS를 흡인합니다. 두 번 반복하고 마지막 세척 후 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다.
   2. 각 플레이트에 750 μl의 사전 차가운 아세톤을 넣고 세포를 긁어냅니다. 두 접시에서 얼음에 2ml 튜브에 아세톤에 세포를 결합합니다.
   3. 정규화를 위한 셀 수
      1. 각 치료에 대해 세포 정량화에 2 개의 추가 플레이트를 사용합니다. 플레이트에서 세포를 분리하려면 각 플레이트에 HE 버퍼 2ml(HBSS 1x, 10m HEPES, 0.075% NaHCO_{3 및} 1mM EDTA)를 추가하고 5분 동안 배양합니다.
      2. HE 버퍼에서 세포를 파이펫팅하여 세포를 수집하고 잘 섞습니다. 총 20μl 세포 용액을 사용하여 혈류계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
3. 메타볼로믹스 센터로 보내기 전에 -80°C에 샘플을 저장하여 가스 크로마토그래피 질량 분광법(GC-MS) 분석을 사용하여 대사산물을 식별하고 정량화한다.