Prøvepreparering for metabolomics: En metode for å forberede celleprøver for metabolittprofilering

Overview

Denne videoen beskriver en teknikk for å forberede brystkreftcelleprøver for metabolittprofilering. Brystkreftceller behandles med østradiol, som binder seg til østrogenreseptor alfa og forårsaker endring i metabolittsammensetningen.

Protocol

1. Metabolomics Analyse Prøvepreparering

1. Cellekultur og behandling
   1. Frø 400.000 MCF7 celler per 10 cm plate i vekstmedium. For hver behandling forberede tre prøver. Bruk to plater i hvert utvalg for å få nok celler til søket. På dag 3, fjern mediet og tilsett 5 ml friskt medium med eller uten^10-8 M Østradiol eller E2 til cellene. Behandle cellene i 24 timer (37 °C i fuktet 5 % CO_{2-atmosfære).}
2. Eksempel på samling
   1. Tilsett 5 ml iskald 1x PBS til platen, aspirer PBS etter kort tilting av platen flere ganger. Gjenta to ganger, og fjern så mye PBS som mulig etter siste vask.
   2. Tilsett 750 μl forkjølet aceton til hver plate og skrap cellene. Kombiner cellene i aceton fra to plater til et 2 ml rør på is.
   3. Celleantall for normalisering
      1. For hver behandling, bruk to ekstra plater for celle kvantifisering. For å løsne cellene fra platen, tilsett 2 ml HE-buffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO₃ og 1 mM EDTA) i hver plate og inkuber i 5 minutter.
      2. Samle og bland cellene godt ved å pipettere celler i HE-bufferen. Bruk totalt 20 μl celleløsning for å telle cellenummeret ved hjelp av et hemocytometer.
3. Oppbevar prøvene ved -80 °C før du sender dem til Metabolomics-senteret for å identifisere og kvantifisere metabolittene ved hjelp av analyse av gasskromatografimassespektrometri (GC-MS).