Overview
Это видео описывает метод подготовки образцов раковых клеток молочной железы для метаболита профилирования. Раковые клетки молочной железы лечатся эстрадиолом, который связывается с альфа-рецептором эстрогена и вызывает изменения в составе метаболита.
Protocol
1. Метаболомика Анализ Образцовая подготовка
- Клеточная культура и лечение
- Семя 400000 MCF7 клеток на 10 см пластины в среде роста. Для каждого лечения подготовьтесь три образца. Используйте две пластины в каждом образце, чтобы получить достаточно клеток для обнаружения. На 3-й день снимите среду и добавьте 5 мл свежей среды с или без 10-8 M эстрадиола или E2 в клетки. Лечить клетки в течение 24 часов (37 градусов по Цельсию в увлажненной 5% CO2 атмосферы).
- Коллекция образцов
- Добавить 5 мл ледяной 1x PBS к пластине, аспирировать PBS после краткого наклона пластины несколько раз. Повторите дважды, и удалить как можно больше PBS, как это возможно после последней стирки.
- Добавьте 750 мкл предхохлого ацетона к каждой пластине и соскреблйте клетки. Смешайте клетки в ацетоне из двух пластин в 2 мл трубки на льду.
- Количество ячеей для нормализации
- Для каждого лечения используйте две дополнительные пластины для количественной оценки клеток. Чтобы разложить клетки с тарелки, добавьте 2 мл буфера HE (1x HBSS, 10 мМ HEPES, 0,075% NaHCO3 и 1 мМ EDTA) в каждую тарелку и инкубировать в течение 5 минут.
- Соберите и хорошо перемешайте клетки путем пипетки клеток в буфере HE. Используйте в общей сложности 20 мкл клеточного раствора для подсчета номера ячейки с помощью гемоцитометра.
- Храните образцы при -80 градусов по Цельсию перед отправкой в центр метаболомики для выявления и количественной оценки метаболитов с помощью анализа масс-спектрометрии газовой хроматографии (GC-MS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.