Summary
الضفدع
Abstract
وضعنا في القيطم البرمائيات المورق فريدة غير الثدييات نموذج لدراسة قدرة بعض بروتينات الصدمة الحرارية (hsps) مثل gp96 لتسهيل عبر تقديم المستضدات فقدوا ذويهم والحصول على فطرية وقابلة للتكيف استجابات الخلايا التائية. طعم الجلد القيطم الرفض يوفر منبرا ممتازا لدراسة قدرة gp96 لانتزاع الطبقة الأولى أ MHC الكلاسيكية (الدرجة الأولى أ) تقتصر ردود الخلايا التائية. بالإضافة إلى ذلك ، في النظام النموذجي القيطم كما يوفر بديلا جذابا لالفئران لاستكشاف قدرة على توليد استجابات gp96 ضد الأورام التي ينظم بها أسفل الدرجة الأولى أ جزيئات الهروب بالتالي مراقبة المناعي. في الآونة الأخيرة ، وقد وضعنا عملية نقل الخلايا في استنساخ بالتبني مقايسة القيطم باستخدام خلايا الكريات البيض البريتوني وتقديم المستضد (ناقلات الجنود المدرعة) ، وأظهرت أن رئيس الوزراء يمكن gp96 الخلايا التائية CD8 الردود في التعديلات المجراة ضد مستضدات التوافق النسيجي الجلد وكذلك ضد الورم التوتة القيطم 15 / 0 الذي لا يعبر عن الطبقة الأولى أ الجزيئات. نحن هنا وصف المنهجية المعنية لتنفيذ هذه المقايسات بما في ذلك نقل الاستنباط ، ويتقطع بالتبني من الكريات البيض البريتوني ، فضلا عن طعم الجلد والمقايسات زرع الورم. بالإضافة إلى ذلك نحن تصف أيضا الحصاد وفصل الكريات البيض في الدم الطرفية المستخدمة في التدفق الخلوي والمقايسات الانتشار التي تسمح لتوصيف مزيد من السكان المستجيب رفض المشاركة في الجلد والردود المضادة للورم.
Protocol
1. الحيوانات
عاشرا المورق X X. gilli الهجينة LG - 6 و LG - 15 isogenetic استنساخ 1 هي من مستعمرة التربية لدينا في جامعة روشستر (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG - 6 وحصة LG - 15 على نفس النمط الفرداني MHC متخالف (أ ج /) ولكنها تختلف في التوافق النسيجي القاصر (H) مواضع. ويتم إنتاج ذرية من هذه الحيوانات المستنسخة التي تكون بيضي ، والتي يتم تفعيلها ضعفاني البيض التي تنتجها الإناث المشع للأشعة فوق البنفسجية الحيوانات المنوية (أي مساهمة الحمض النووي للسلالة).
استخدام القفازات هو اختياري. بعض الناس يفضلون عدم ارتدائها لأنه من الصعب التعامل مع الضفادع (زلقة) في واقع الأمر يبدو لجعل الضفادع غير مريحة.
2. تنقية gp96 في الفترة من 15 / 0 ورم (تعرب عن كل من الورم والصغرى H - AGS)
وقد سبق وصفها تنقية Gp96 2 ، 3. باختصار ، يتم تنقيته بواسطة gp96 50-70 ٪ كبريتات الامونيوم تجزيء ، تليها كونا - ثنائي إيثيل أمينو إيثيل sepharose واللوني. ويمكن الحصول على حوالي 20-50 ميكروغرام من البروتين لكل 1 مل من نسيج الورم. يتم تحديد نقاوة التي تعدها SDS - PAGE وتلوين قطعة من الجبن.
3. الاستنباط وحصاد الكريات البيض البريتوني (PLS) من الضفادع الصغرى LG - 6 H - AG - المتباينة
- تنمو بين عشية وضحاها 25 مل E. ثقافة القولونية في أنبوب مخروطي 50 مل عند 37 درجة مئوية مع الهز.
- الحرارة اليوم التالي قتل البكتيريا بواسطة الغلي لمدة 1 ساعة.
- الطرد المركزي الحرارة قتل E. القولونية لمدة 15 دقيقة في 2000 دورة في الدقيقة (1،500 ز) في 4 درجات مئوية.
- إزالة وطاف resuspend الكرية الجرثومي في 1 / 10 عشر حجم ثقافة الأصلي (2.5 مل) في APBS. عند هذه النقطة ثقافة البكتيرية جاهز للاستخدام ويجب أن تستخدم في غضون 24 ساعة.
- حقن intraperitoneally (IP) 200 (لضفدع 2 بوصة) أو 300 ميكرولتر (لضفدع 3 بوصة) من إعداد الحرارة في قتل البكتيريا الضفادع باستخدام قياس 25 5 / 8 إبرة.
- ويتم حصاد بعد ثلاثة أيام من الحقن بواسطة PLS غسيل داخل الصفاق.
- PL قبل الحصاد ، والضفادع البالغين تخدير عن طريق الغمر في محلول مائي 0.1 ٪ من سلفونات الميثان tricaine (TMS ، MS - 222) مخزنة مع بيكربونات الصوديوم لمدة تصل إلى 5 دقائق حتى يتوقف عن الحركة (المدة تعتمد على الحجم والعمر). الحيوانات في غضون 10-20 دقيقة اعقاب بعد العلاج.
- تطهير بطن الضفدع مع كمية صغيرة من الايثانول 70 ٪.
- ضخ 5 مل (لضفدع 2 بوصة) أو 10 مل (لضفدع 3 بوصة) من APBS معقمة قبل تدفئته في درجة حرارة الغرفة في التجويف البريتوني باستخدام قياس 18 1 ½ الإبرة. إزالة الإبرة والتدليك بلطف الضفدع لمدة دقيقة لضمان أن حقن equilibrates العازلة مع السوائل في تجويف الجسم.
- استخدام جديد قياس 18 1 ½ دون إبرة حقنة لجمع السائل البريتوني التي سوف بالتنقيط من الجزء الخلفي من الإبرة إلى أنبوب تنظيف 50 مل المخروطية. تأكد لاسترداد أكبر قدر من حجم الأولي حقن ممكن. نتوخى الحذر لتجنب الأوعية الدموية في المنطقة الوسطى من منطقة البطن.
- مرة واحدة ويتم حصاد PLS وضع الضفدع في وعاء مع المياه الضحلة حتى يكون مستيقظا النقطة التي يمكن وضعها مرة أخرى في قفصه.
4. يتقطع والتبني نقل LG - 6 الثابتة والمتنقلة إلى متلقين LG - 6 ساذج
- يغسل مرة واحدة مع PLS APBS الباردة وأجهزة الطرد المركزي 1000 دورة في الدقيقة لهم في (750 غ) لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إزالة وطاف resuspend الثابتة والمتنقلة في APBS.
- نبض PLS مع gp96 بتركيز 1 ميكروغرام لكل gp96 PLS 5 × 5 10.
- بمجرد أن يتم إضافة كمية مناسبة من gp96 لالثابتة والمتنقلة ، التي مزجها pipeting واحتضان على الجليد لمدة 1 ساعة.
- الطرد المركزي الخلايا إما في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية أو على 14000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة لإزالة أي غير منضم gp96.
- غسل PLS 3X مع APBS الباردة لضمان عدم وجود المتبقية gp96 اليسار.
- Resuspend الثابتة والمتنقلة نابض بتركيز 5 × 5 10 PLS لكل 300 ميليلتر.
- نقل Adoptively الثابتة والمتنقلة عن طريق الحقن IP باستخدام قياس 25 08/05 الإبرة. ضخ 300 ميكرولتر من PLS نابض (5 × 10 5 الخلايا) للحيوان الواحد.
- الضفادع تحتاج إلى معبي 3 أيام على الأقل قبل الشروع في الاستمرار مع الجلد أو طعم التحدي التجارب الورم.
5. طعم جلدي الفحص
الجلد رفض الكسب غير المشروع هو مقايسة راسخة في القيطم 4 ، 5 ، 6. في القيطم ، مستلم الجلد المانحة ترفض عرض من 1 أو 2 عدم التطابق النمط الفرداني MHC داخل 18-22 يوما في 21-22 درجة مئوية. في المقابل ، رفضت ترقيع الجلد بين 6 و LG - LG - 15 الحيوانات المستنسخة التي تختلف فقط من خلال التعديلات H - AGS ببطء أكثر (أكثر من 30 يوما). ومع ذلك ، هو تسارع هذا الرفض في متلقي ثاواستعان المنظمون ر ضد التعديلات المانحة H - AGS إما عن طريق الجلد طعم السابقة أو عن طريق التحصين مع gp96 تنقيته من الجهة المانحة. ليس الرفض في جميع يحدث عندما المانحة والمتلقية متطابقة وراثيا (مثل الحيوانات المستنسخة أو الفطرية تماما). ولذلك ، فإن هذا الأسلوب البسيط هو قوية جدا لوصف الاستجابات المناعية في الجسم الحي التي تسببها gp96.
- تخدير الضفادع المانحة كما هو موضح في 3.7.
ملاحظة : الحد الأدنى فقط الاحتياطات الواجب اتخاذها منذ القيطم إنتاج قوية مضادة للميكروبات الببتيدات (على سبيل المثال ، magainin) في الجلد الذي يغني عن الحاجة إلى إجراءات العقيم الإجمالي. في الواقع ، فإن العلاج على نوع من الضفادع مع أي مطهر تكون ضارة للبشرة. بالإضافة إلى ذلك ، القيطم ليس لدينا أي مسببات الأمراض التي يمكن نقلها للبشر. لذا ، فإن استخدام قفازات اختيارية. ومع ذلك ، فإن جميع الأدوات المستخدمة تشريح يلزم تعقيمها ، وجميع الحلول ضرورة أن تكون معقمة. - قطع وإزالة صغير (20 مم X 5 ملم) قطعة من الجلد البطني (جلد البطن الذي يظهر فضي بسبب وجود الخلايا الصباغية irridophore) من الضفادع المانحة LG - 15 باستخدام المقص.
- مكان الجلد في APBS Petridish احتواء ويبقيه على الجليد. التلاعب في أنسجة البشرة بلطف شديد ، وتجنب إمساكه بين ملقط.
- باستخدام مقص الحلاقة أو قطع ترقيع الفردية إلى 5 مم X قطعة 5 مم. الحفاظ على شظايا في APBS على الجليد.
- في هذه المرحلة هو وضع الضفدع المانحة في حاوية مع المياه الضحلة حتى يكون مستيقظا ومن ثم يتم وضعها في المياه التي تحتوي على المضادات الحيوية (Penstrep في تركيز 5 ملغ / لتر). يتم الاحتفاظ الضفدع في الماء مع المضادات الحيوية لمدة يومين وعند هذه النقطة فإنه يتم إرجاعها في الماء العادي. الجرح الصغير في الموقع حيث تم إزالة الجلد لا بد من خاط ويشفى في غضون أسبوع.
- تخدير LG - 6 المتلقي الضفادع.
- إجراء شق صغير في الجلد (العودة) الظهرية للمتلقي وتضاف 5 مم X طعم 5 مم تحت الجلد مع الجانب فضي تصل. يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء الكبيرة تحت الجلد لأن ذلك قد يؤدي إلى تشريد أو حتى الخسارة من الكسب غير المشروع.
- تأكد لاحظ علامات مقص وملقط على ترقيع لأنه لم يتم احتساب هذه كما رفض طعم التهديف مرة يبدأ.
- 24 ساعة في وقت لاحق جزءا من الجلد تتراكب المضيف يحتاج إلى إزالتها من الكسب غير المشروع.
- تخدير LG - 6 المتلقي الضفادع. التعامل مع الحيوان كما هو موضح في 5.1.
- تعقيمها باستخدام مقص قطع نافذة حول الفساد والكسب غير المشروع بحيث يمكن تصور بحرية. يجب الحرص على عدم لمس الجلد المانحة أو للحث على النزيف. السماح للضفدع استرداد كما هو موضح في 5.5.
- بدء التسجيل في الكسب غير المشروع على الفور باتخاذ رسم. يتحدد الجلد رفض الكسب غير المشروع من قبل في المئة من تدمير irridophores المطعمة على الجلد.
- الطعوم تحتاج إلى فحص كل 2-3 أيام ولكن الحيوانات لا تحتاج إلى تخدير لهذا الغرض. لتصور الطعوم ، والضفادع تحتاج إلى أن توضع في petridish تشريح تحت المجهر.
6. كله يشن Immunohistology من الجلد المزروع
وقد الضفدع كامل جبل immunohistology الموصوفة سابقا 6. باختصار ، هو تخدير الضفدع ووضعها تحت المجهر على منشفة ورقية معقمة قبل مبللة بالماء الضفدع (هو أيضا مجال عمل أعدتها جو معقم و مطهر). ثم يتم حصاد زرع الجلد مع كمية صغيرة من الجلد المحيطة المضيفة واتسخت مع الأضداد على نحو مماثل لتلطيخ خلية للتحليل التدفق الخلوي 6. الأدوات المعقمة ومخازن العقيمة الحاجة لاستخدامه. بعد تلوين الجلد توضع على شريحة المجهر وضغطت بلطف مع انزلاق الغطاء. عند هذه النقطة يمكن أن يكون الجلد تصور باستخدام مجهر نيون للسكان مختلفة من الخلايا التي تسللت الكسب غير المشروع. بعد هذا الإجراء يتم الاحتفاظ الضفدع في الماء مع المضادات الحيوية كما هو موضح في القسم 5.5. وعاد في الماء العادي. الجرح الصغيرة اليمنى حيث تم إزالة الجلد تشفى خلال أسبوع.
7. توصيف الكريات البيضاء في الدم
- قبل إزالة الدم من الضفادع ، واحد يحتاج إلى إعداد "الإبر زجاج" عن طريق سحب عقيمة ماصات باستور على اللهب. هو شحذ اقصى غرامة ماصة تحت stereomicroscope. ثم يتم توصيل ماصة للطموح أنبوب من البلاستيك.
جميع الصكوك مثل ملقط ومقص يلزم تعقيمها قبل الاستخدام. - أيضا بإعداد الجليد الباردة APBS 10 مل من محلول الهيبارين وذلك بإضافة 50 وحدة هيبارين في 1 مل من APBS. يبقي الحل على الجليد. كل الحلول يجب أن تستخدم العقيمة.
- تخدير الضفدع كما هو موضح في 3.7 ، واتباع نفس إجراءات التعامل مع الحيوانات كما هو موضح في 5.1. .
- قطع الجلد فوق سفح الخلفي لفضحالوريد طرسوس الظهرية.
- ملء ماصة باستور 1-2 مع مل من محلول + APBS الهيبارين.
- إدراج "إبرة الزجاجي" في الوريد والبدء في جمع الدم عن طريق الشفط ببطء مع الفم. فمن المهم أن يكون هناك حل APBS + الهيبارين في "إبرة الزجاجي" لأن هذا سوف يمنع الدم من التخثر ، وانسداد رأس الإبرة.
- ويمكن الحصول على 1-2 مليلتر من الدم من الضفادع one الحجم المتوسط.
- شق صغير في ساق الضفدعة لا بد من خاط الجرح ويشفى في غضون أسبوع واحد.
- أجهزة الطرد المركزي للدم في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إزالة طاف وغسل الخلايا 1X مع 10 مل من APBS الباردة.
- تراكب 2 مل من الدم (1-5 × 10 6 خلايا) إلى 1 مل من Histopaque ficoll 1.077 (سيجما) قبل تدفئته في درجة حرارة الغرفة من أجل فصل الكريات البيض في الدم من خلايا الدم الحمراء.
- 20 دقيقة في اجهزة الطرد المركزي 1000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة دون فرامل ، ثم جمع الفرقة الكريات البيض.
- غسل خلايا 2X مع APBS بواسطة الطرد المركزي عند 1400 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية لإزالة ficoll المتبقية.
- عند هذه النقطة الخلايا جاهزة للملطخة الأجسام المضادة للتحليل التدفق الخلوي ، أو أن يكون استخدامها لفحوصات في المختبر الثقافة.
8. ورم زرع الفحص
- حوالي اسبوع قبل ذوبان الجليد من التجربة دفعة جديدة من الخلايا 15 / 0 الورم وتأكد من أن الخلايا تبدأ في النمو بشكل جيد. وصفت ببلاغة المتوسطة الثقافة في المقطع التالي ، وبمزيد من التفصيل في 3.
- توسيع الخلايا 15 / 0 الورم.
- في يوم من التجربة ، عد الخلايا وتحديد موت الخلية التي الاستبعاد التريبان الأزرق. وينبغي أن موت الخلايا تكون أقل من 5 ٪. غسل خلايا 1X في APBS الباردة ، والطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة في 4 لمدة 10 دقيقة درجة مئوية.
- Resuspend الخلايا في مستنبت ورم في كثافة الخلايا 5 × 5 15 / 0 10 في 300 ميليلتر.
- زرع 5 × 10 5 خلايا في 300 ميليلتر في حجم الضفدع طريق الحقن تحت الجلد باستخدام جهاز قياس 25 5 / 8 إبرة على جانب واحد من الجانب (الظهر) الظهرية من الحيوان.
- وسوف يبدأ نمو الورم في غضون 2-3 أسابيع بعد التحدي الورم. ويجب ملاحظة ظهور الورم الأولي وحجم الورم يحتاج إلى أن يسجل كل 2-3 أيام. ويقاس حجم الورم (ارتفاع طول X عرض X) باستخدام الفرجار.
- بمجرد أن الورم ينمو إلى 3500 ملم 3 أو الضفدع يبدأ يبحث السبات العميق ، لا بد من الموت الرحيم لمنع عدم الراحة.
9. مطلوب الكواشف :
- التخزين المؤقت البرمائيات الفوسفات المالحة (APBS) : 6.6 غرام / لتر كلوريد الصوديوم ، 1.15 غ / ل نا 2 هبو 4 ، 0.2 غرام / لتر KH 2 ص. الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 باستخدام 10N هيدروكسيد الصوديوم وتعقيمها من خلال تصفية 0.2 ميكرون فلتر.
- Tricaine سلفونات الميثان (TMS ، MS - 222) (الهلال بحوث المواد الكيميائية CAS # 886-86-2).
- بيكربونات الصوديوم (فيشر العلمية S - 233-500).
- Histopaque - 1077 (سيغما الدريخ 10771-100 مل)
- الهيبارين ملح الصوديوم (سيغما الدريخ - H3149 50KU)
- مستنبت لالقيطم 15 / الأورام 0 [انظر لمزيد من التفاصيل 3] : 1 لتر من المتوسط DMEM Iscove القاعدية (Gibco Invitrogen - 11965) مع الانسولين 10 مل و 10 مل غير الأحماض الأمينية الأساسية ، و 10 مل من البنسلين الستربتوميسين ؛ 10 ميكروغرام / مل من الكانامايسين ، 3 مل من primatone (شيفيلد قسم المنتجات) ، 1 مل من المركابتويثانول - β2 ، و 3.02 غرام NaHCO 3 في الماء (7.0 درجة الحموضة). يتم تخفيف هذه الوسيلة للالأسمولية البرمائيات بإضافة 30 ٪ من الماء المقطر المزدوج ، وتستكمل مع مصل بقري جنيني من 5 ٪ ، 20 ٪ superantant من A6 الكلى القيطم خط الخلية ، و 0.25 ٪ من مصل القيطم العادي.
10. ممثل النتائج
الشكل 1. تحليل Stereomicroscopic رفض طعم الجلد 12 يوما بعد الزرع. LG - 6 الضفدع المستنسخة حصل على الكسب غير المشروع من الجلد إما (أ) متطابقة MHC - LG - 6 (لا يظهر أي الرفض) أو (B). متبرع MHC - المتباينة outbred (80 ٪ الرفض) الأسهم تظهر الخلايا الصباغية iridophore فضية بمناسبة صحية (غير رفض) المطعمة الأنسجة. (*) مارك ملقط ليس بسبب الرفض.
الشكل 2. Gp96 يسهل عبر تقديم مستضدات الأورام في القيطم. LG - 15 الثابتة والمتنقلة (5 × 10 5) ونابض لمدة 1 ساعة على الجليد إما مع APBS (مراقبة سلبية) ، 1 ميكروغرام من المؤتلف gp96 تنقيته من E. ثقافة القولونية ، أو 1 أو 0.5 ميكروغرام من gp96 المنقى في الفترة من 15 / 0 نسيج الورم. بعد 3 يغسل ، تم نقل الخلايا إلى متلقين adoptively الكبار LG - 15 (1 × 10 6 / الفرد). بعد ثلاثة أيام ، ويعيش 15 / 0 الخلايا السرطانية (5 × 10 5) وكانتزرع عن طريق الحقن الشوري. كل منحنى يمثل حركية نمو الورم في أحد الضفادع. وتم رصد آخر أيام التحدي عندما ظهرت للمرة الأولى الأورام ، وتقرر حجم الورم بشكل دوري مع (طول × عرض × سماكة) الفرجار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والقيطم البرمائيات هي فريدة من نوعها تنوعا غير الثدييات نموذج لدراسة الحصانة. وقد أسفر استخدام واسعة النطاق في مجال الأبحاث الطبية البيولوجية والمناعية في العديد من الأدوات البحثية الهامة مثل استنساخ MHC تعريف LG - 6 و LG - 15 فضلا عن خطوط مختلفة من الخلايا والأجسام المضادة وحيدة النسيلة. استخدام هذه الأدوات المختلفة التي أقمناها في المختبر والمجراة في المقايسات لدراسة قدرة بروتينات الصدمة الحرارية مثل gp96 للتوسط قوية حج محددة لمكافحة طفيفة H - AG والردود المضادة للورم خلايا تي 7. هذا النظام يسمح لنا نموذجا لتحقيق مزيد من الخصائص المناعية gp96 خلال فتيلة ومراحل خلية المستجيب.
تتعلق المرحلة فتيلة ، والدراسات المبدئية لهذه الاستجابات المستخدمة تحت الجلد مع التحصين التي تتطلب تنقية gp96 حقنتين من 10 ميكروغرام gp96 على فترات قبل اسبوعين في المقايسات فيفو مثل ترقيع الجلد أو زرع ورم 2 و 8. في المقابل ، عبر أسلوب العرض وضعنا (7) وتستخدم في الوقت الراهن هو أكثر ملاءمة وكفاءة. مزايا متعددة من هذه الاستراتيجية تشمل فتيلة الوقت وكمية البروتين المطلوبة لكل تجربة. على سبيل المثال من أجل تحصين حيوان يستغرق 4 أسابيع و 20 ميكروغرام من gp96 ، بينما مع فتيلة PL نحتاج سوى 3 أيام و0،5-1 ميكروغرام من البروتين. بالإضافة إلى ذلك هناك أقل تقلب لأن فتيلة يتكون من حقن واحد فقط من PLS مع نابض gp96. هذه هي الخطوة الحاسمة لأنه قد يكون فقدان إذا انسحبت الإبرة بسرعة جدا خلال واحدة من التطعيم عن طريق الحقن في الشوري ، وجزء كبير من بروتين يسبب بالتالي تقلب المزيد من الحرية الفردية. الأهم من ذلك ، هذا الاختبار عبر العرض يوفر وسيلة لتحقيق مزيد من آليات gp96 بوساطة الاستجابات المناعية. على سبيل المثال ، يمكننا أن تعدل أيضا التعبير عن جزيئات معينة مثل الطبقة الأولى أ على سطح PLS قبل يتقطع مع gp96 للتحقيق دورها في الاستجابات المناعية وتوسطت gp96 T فتيلة الخلية. ويمكن أيضا في عملية استيعاب gp96 أن تدرسها قبل تفرخ PLS مع الأجسام المضادة أو المنافسين التدخل مع مستقبلات التقامي 7.
تتعلق المرحلة المستجيب ، ونموذج القيطم ليس فقط مناسبة لتوصيف المستجيبات الخلايا المناعية في المختبر من قبل التدفق الخلوي والقتل وانتشار المقايسات 8 ، 9 ، ولكنها توفر أيضا قوة في الجسم الحي المقايسات مثل الجلد H - AG - المتباينة طفيفة ترقيع وورم فحوصات الزرع. وراسخة كل من هذه المقايسات في النموذج القيطم لكن هناك بضع خطوات الهامة التي يجب اتباعها. يجب على سبيل المثال في مقايسة اهتمام خاص ترقيع الجلد يتم دفعها عند التعامل مع الكسب غير المشروع وخصوصا عندما قطع من نافذة الجلد المضيف تتراكب. الإطار يجب أن يكون أصغر قليلا من الكسب غير المشروع في حد ذاته بحيث طعم ولن تسقط. وعلاوة على ذلك ، وخلال زرع ورم من المهم لحقن النصف الأول من السيطرة على الحيوانات التي تتبعها تلك التجريبية من والانتهاء من النصف الثاني من الضفادع السيطرة. وسوف يضمن هذا الورم قابلة للحياة خلال عملية الحقن وسوف تنتج بيانات أكثر اتساقا. حقيقة أن هذا النظام يعتمد على النموذج الحيوانات المستنسخة يتيح المزيد من الدراسات لتوسيع الخلايا المستجيب يحفزه hsps باستخدام بالتبني نقل الخلية 10.
باختصار ، قدم هنا تسليط الضوء على أساليب القيطم الضفدع كنظام نموذج استثنائي غير الثدييات لدراسة hsps مثل gp96 دور في مراقبة محصنة والاستجابات المناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويقدر بامتنان تربية الحيوانات الخبراء التي يقدمها مارتن تينا وديفيد اولبرايت. وأيد هذا البحث عن طريق المنح T32 - AI - 07285 (HN) ، NIH R25 2GM064133 (TCL) ، 1R03 - HD061671 - 01 ، R24 - AI - 059830-06 من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents needed: | |||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | |||
| NaCl, 1.15 g/L | |||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | |||
| KH2PO | |||
| 10N NaOH | |||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | |||
| Iscove DMEM basal medium | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Insulin | |||
| Non-essential amino acids | |||
| Penicillin-streptomycin | |||
| Kanamycin | |||
| Primatone | Sheffield Products Division | ||
| β2-mercapt–thanol | |||
| NaHCO3 | |||
| 30% double distilled water | |||
| 5% featal bovine serum | |||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | |||
| 0.25% of normal Xenopus serum | |||
| Materials and Equipment: | |||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | |||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD Biosciences | ||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD Biosciences | ||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD Biosciences | ||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD Biosciences | ||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | |||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon BD | ||
| Razor blades | |||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | ||
| 10 cm glass petri dishes | |||
| 9" Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR international | ||
| Tygon tubing | |||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | ||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Helios calipers | |||
| Dissecting microscope | |||
| High intensity illuminator | |||
| Hemacytometer | |||
| Un-bunsen burner | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| Centrifuge |
References
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u, L, Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).
- Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions. Methods. 32, 42-53 (2004).
- Chardonnens, X., Pasquier, D. u, L, Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens. Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).
- Du Pasquier, L., Bernard, C. C. Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus. Differentiation. 16, 1-7 (1980).
- Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method. Transplantation. 83, 159-166 (2007).
- Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).
- Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins. J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).
- Morales, H., Robert, J. In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus. Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).
- Maniero, G. D., Robert, J. Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus. Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).
