Summary
Grodan
Abstract
Vi har utvecklats i amfibie Xenopus laevis ett unikt icke-däggdjur modell för att studera förmågan hos vissa heat shock protein (hsps) såsom gp96 syfte att underlätta gränsöverskridande presentation av chaperoned antigener och framkalla medfödda och adaptiva T-cells svar. Xenopus huden avstötning ger en utmärkt plattform för att studera förmågan hos gp96 att framkalla klassiska MHC klass Ia (klass Ia) begränsad T-cell svar. Dessutom ger Xenopus modellsystem också ett attraktivt alternativ till möss för att utforska möjligheterna för gp96 att generera reaktioner mot tumörer som har ned-reglerade sin klass Ia molekyler därmed undkomma immunförsvaret övervakning. Nyligen har vi utvecklat en adoptiv-analys cell överföring Xenopus kloner med peritoneal leukocyter som antigen presenterande celler (APC), och visat att gp96 kan prime CD8 T cells svar in vivo mot mindre antigener histocompatibility hud samt mot Xenopus thymic tumören 15 / 0 som inte uttrycker molekyler klass Ia. Vi beskriver här metoden inblandade att utföra dessa tester inkluderande framtagning, pulserande och adoptiv transfer av peritoneal leukocyter, samt hudtransplantation och tumören analyser transplantation. Dessutom är vi också beskriver skörd och separation av perifert blod leukocyter används för flödescytometri och tester spridning som möjliggör ytterligare karaktärisering av effektor befolkningen involverade i huden avslag och anti-tumör svar.
Protocol
1. Djur
X. laevis x X. Gilli hybrider LG-6 och LG-15 isogenetic kloner 1 är från vår uppfödning koloni vid University of Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 och LG-15 har samma heterozygot MHC haplotyp (a / c) men skiljer sig på mindre histocompatibility (H) loci. Avkomma från dessa kloner produceras av gynogenesis, där diploid ägg som producerats av det kvinnliga aktiveras av UV-bestrålat spermier (ingen DNA bidrag till avkomman).
Användning av handskar är fakultativ. En del människor föredrar att inte bära dem eftersom det är svårare att hantera grodor (hala) och i själva verket det verkar göra grodor obekväm.
2. Rening av gp96 från 15 / 0 tumör (uttrycker både tumör och Minor H-AGS)
Gp96 rening har tidigare beskrivits 2, 3. Kortfattat är gp96 renas genom 50-70% ammoniumsulfat fraktionering, följt av Cona-sepharose och DEAE kromatografi. Om 20-50 mikrogram protein kan erhållas per 1 ml av tumörvävnad. Renhet av preparatet bestäms av SDS-PAGE och spjälka färgning.
3. Elicitation och skörd av peritonealdialys Leukocyter (PLS) från Mindre H-Ag-olika LG-6 Grodor
- Odla en 25 ml natten E. Coli kultur i ett 50 ml koniskt rör vid 37 ° C med skakning.
- Nästa dag värme dödar bakterierna genom att koka den i 1 timme.
- Centrifugera värmen dödade E. Coli i 15 min vid 2000 rpm (1500 g) vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och suspendera den bakteriella pelleten i 1 / 10: e den ursprungliga kulturen volym (2,5 ml) i APBS. Vid denna punkt bakterieodling är klar att användas och måste användas inom 24 timmar.
- Injicera intraperitonealt (ip) 200 (för en 2 tums groda) eller 300 mikroliter (för en 3 tum groda) av den värme som dödade-bakteriell förberedelse per groda med en 25 gauge 5 / 8 nål.
- Tre dagar efter injektionen PL skördas efter intraperitoneal magsköljning.
- Innan PL skörd, vuxna grodor bedövas genom nedsänkning i en 0,1% vattenlösning av tricaine metan sulfonat (TMS, MS-222) buffras med natriumbikarbonat för upp till 5 min tills all rörelse upphör (längd beror på storlek och ålder). Djur vaknar inom 10-20 minuter efter behandling.
- Desinficera buk grodan med en liten mängd 70% etanol.
- Injicera 5 ml (för en 2 tums groda) eller 10 ml (för en 3 tum groda) steril APBS förvärmas vid rumstemperatur in i bukhålan med hjälp av en 18 gauge 1 ½ nål. Ta bort nålen och försiktigt massera grodan en minut för att försäkra att den injicerade bufferten jämvikt med med vätska i kroppen hålighet.
- Använd en ny 18 gauge 1 ½ nål utan en spruta för att samla peritonealvätska som kommer att droppa från baksidan av nålen i en ren 50 ml koniska rör. Se till att hämta så mycket av det injicerade initiala volym som möjligt. Var noga med att undvika blodkärl i centrala delen av bukhålan.
- När PL skördas lägger grodan i en behållare med grunt vatten tills den är vaken varefter den kan placeras tillbaka i sin bur.
4. Pulserande och adoptiv transfer av LG-6 Pls Into Naive Lg-6 Mottagare
- Tvätta PL gång med kallt APBS och centrifugera dem vid 1000 rpm (750 g) under 10 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och suspendera bipacksedlar i APBS.
- Puls PLS med gp96 vid en koncentration av 1 mikrogram gp96 per 5 x 10 5 PLS.
- När lämplig mängd gp96 läggs till i PL, blanda dem genom pipeting och inkubera på is i 1 timme.
- Centrifugera cellerna antingen vid 1000 rpm i 10 min vid 4 ° C eller vid 14.000 rpm i 1 minut för att avlägsna obundet gp96.
- Tvätta PL 3X med kallt APBS att säkerställa att det inte finns någon återstående gp96 kvar.
- Resuspendera pulsad PL vid en koncentration på 5 x 10 5 PL per 300 mikroliter.
- Adoptively överföra PL med ip injektion med 25 gauge 5 / 8 nål. Injicera 300 mikroliter av pulsad PL (5 x 10 5 celler) per djur.
- Grodor behöver primas minst 3 dagar innan du fortsätter med hudtransplantation eller tumör experiment utmaning.
5. Hudtransplantation analys
Hud avstötning är en väletablerad test på Xenopus 4, 5, 6. I Xenopus avvisar en mottagare donator hud Visar 1 eller 2 MHC obalanser haplotyp inom 18-22 dagar vid 21-22 ° C. Däremot är hudtransplantation mellan LG-6 och LG-15 kloner som skiljer sig bara genom att mindre H-Ags avvisade långsammare (mer än 30 dagar). Detta är dock avvisande accelererade i mottagare that ha satsats mot givare mindre H-Ags antingen genom en tidigare hudtransplantation eller genom immunisering med gp96 renas från givaren. Inga avslag på samtliga uppstår när givaren och mottagaren är genetiskt identiska (t.ex. klonade eller helt inavlade djur). Därför är denna enkla tekniken mycket kraftfull för att karakterisera in vivo immunsvar framkallat av gp96.
- Bedöva givare groda som beskrivs i 3.7.
Obs: Endast minimalt försiktighetsåtgärder behöver vidtas eftersom Xenopus producerar potent anti-mikrobiella peptider (t ex magainin) i huden som undanröjer behovet av totala aseptisk teknik. I själva verket skulle behandling av groda med något desinfektionsmedel vara skadligt för huden. Dessutom har Xenopus inga patogener som kan överföras till människor. Därför är användning av handskar som tillval. Men alla de dissektion instrument som används måste autoklaveras och alla lösningar måste vara sterila. - Klipp ut och ta bort en liten (20 mm x 5 mm) bit ventrala huden (bukhuden som verkar silverglänsande på grund av närvaron av irridophore pigmenterade celler) från en LG-15 givare groda med sax.
- Placera huden på ett Petridish innehåller APBS och hålla den på is. Manipulera huden vävnad mycket försiktigt, undvika att hålla det i mellan pincett.
- Med hjälp av en rakkniv eller sax klippa enskilda transplantat i 5 mm x 5 mm bitar. Håll fragment i APBS på is.
- Vid denna punkt givaren grodan är placerad i en behållare med grunt vatten tills den är vaken och då är det placeras i vatten som innehåller antibiotika (Penstrep vid koncentration på 5 mg / L). Grodan hålls i vatten med antibiotika i två dagar varvid det återförs i vanligt vatten. Det lilla såret på platsen där huden togs bort behöver inte vara sydde och läker inom en vecka.
- Bedöva mottagaren LG-6 groda.
- Gör ett litet snitt på rygg (baksidan) hud hos mottagaren och sätt i 5 mm x 5 mm transplantat under huden med den silverglänsande uppåt. Var noga med att inte införa stora luftbubblor under huden eftersom det kan leda till förskjutning eller ens förlust av transplantat.
- Se till att du notera sax och pincett markeringarna på transplantaten eftersom dessa inte räknas som avstötning när scoring startar.
- 24 timmar senare en del av den överliggande värd hud behöver tas bort från transplantat.
- Bedöva mottagaren LG-6 groda. Hantera djur som beskrivs i 5.1.
- Använda autoklaveras sax klippa ut ett fönster runt transplantat så att transplantatet fritt kan visualiseras. Var noga med att inte röra givaren huden eller att inducera blödning. Låt grodan återhämta som beskrivs i 5.5.
- Starta poäng transplantatet direkt genom att ta en skiss. Hud avstötning bestäms av procent av förstörelsen av irridophores på ympade huden.
- Transplantaten måste kontrolleras var 2-3 dagar, men djuren behöver inte vara sövd för detta. Att visualisera transplantat, grodorna måste placeras i en petridish under ett dissekera mikroskop.
6. Hela montering Immunohistology av transplanterade hud
Frog hela montering Immunohistology har tidigare beskrivits 6. Kortfattat är grodan bedövas och placeras under mikroskop på en steril pappershandduk före våta groda vatten (arbetsområdet är också aseptiskt beredda). Den transplanterade huden är sedan skördas tillsammans med en liten mängd av omgivande värd hud och det är färgade med antikroppar på samma sätt som cellfärgning för flödescytometri analys 6. Autoklaveras instrument och sterila buffertar måste användas. Efter färgning av huden placeras på ett objektglas och försiktigt pressas med ett täckglas. Vid denna punkt i huden kan visualiseras med hjälp av en fluorescerande mikroskop för olika cellpopulationer som har infiltrerat transplantat. Efter ingreppet grodan hålls i vatten med antibiotika som beskrivs i avsnitt 5.5. och återvände i vanligt vatten. Det lilla såret vänster där huden togs bort läker inom en vecka.
7. Karakterisering av blod leukocyter
- Innan du tar bort blod från grodan, måste man förbereda "glas nålar" genom att dra sterila Pasteur pipetter över eld. Den fina extremitet av pipetten är skärpt under stereomikroskop. Pipetten kopplas sedan till en strävan plastslang.
Alla instrument som pincett och sax måste autoklaveras före användning. - Också förbereda iskall 10 mL APBS och heparin lösning genom att tillsätta 50 enheter heparin per 1 ml APBS. Håll lösningen på is. Alla använda lösningar måste vara sterila.
- Bedöva groda som beskrivs i 3,7, och följer samma rutiner djurhantering som i 5.1. .
- Skär huden ovanför den bakre foten för att exponerarygg hasled ven.
- Fyll pasteurpipett med 1-2 mL APBS + heparin lösning.
- Sätt i "glasnål" i en ven och börja samla blodet genom att långsamt aspirering med munnen. Det är viktigt att ha APBS + heparin lösning i "glasnål" eftersom det förhindrar att blodet levrar sig och täpper till spetsen på nålen.
- 1 till 2 mL blod kan erhållas från en medelstor groda.
- De små snitt på grodans ben behöver inte vara sydde och såret läker inom en vecka.
- Centrifugera blodet vid 1000 rpm i 10 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och tvätta cellerna 1X med 10 ml kallt APBS.
- Låt 2 ml blod (1-5 x 10 6 celler) på 1 ml Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma) förvärmas i rumstemperatur för att separera blodet leukocyter från de röda blodkropparna.
- Centrifugera 20 min vid 1000 rpm vid rumstemperatur utan broms, och sedan hämta ut leukocyter bandet.
- Tvätta cellerna 2X med APBS genom centrifugering vid 1400 rpm i 10 min vid 4 ° C för att ta bort kvarvarande Ficoll.
- Vid denna punkt cellerna är redo att färgas med antikroppar för flödescytometri analys, eller att använda för in vitro-kultur-analyser.
8. Tumör Transplantation analys
- Ungefär en vecka före försöket tina upp ett nytt parti på 15 / 0 tumörceller och se till att cellerna börjar växa bra. Odlingsmedium är kortfattat beskrivs i nästa avsnitt och mer detaljerat i 3.
- Expandera 15 / 0 tumörceller.
- På dagen för experimentet, räkna celler och bestämmer celldöd genom Trypan blå utslagning. Celldöd bör vara mindre än 5%. Tvätta cellerna 1X i kallt APBS, och centrifugera vid 1000 rpm vid 4 ° C i 10 min.
- Resuspendera cellerna i tumören odlingsmedium vid en densitet av 5 x 10 5 15 / 0 celler per 300 mikroliter.
- Transplant 5 x 10 5 celler i 300 mikroliter volym per grodan genom subkutan injektion med en 25 gauge 5 / 8 nål på ena sidan av den dorsala (bakre) sidan av djuret.
- Tumörtillväxt kommer att börja inom 2-3 veckor efter tumör utmaning. Den ursprungliga tumören inställelse skall noteras och tumörvolymen måste registreras varje 2-3 dagar. Tumörvolymen (höjd x längd x bredd) mäts med hjälp av skjutmått.
- När tumören växer till 3500 mm 3 eller grodan börjar titta slö, måste det avlivas för att förhindra obehag.
9. Reagenser som behövs:
- Amfibie Fosfatbuffrad saltlösning (APBS): 6,6 g / L NaCl, 1,15 g / L Na 2 HPO 4, 0,2 g / L KH 2 PO. pH till 7,5 med hjälp av 10N NaOH och filtrera steriliseras genom 0,2 ìm filter.
- Tricaine Metan sulfonat (TMS, MS-222) (Crescent Research Chemicals CAS # 886-86-2).
- Natriumbikarbonat (Fisher Scientific S-233-500).
- Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10.771-100 ml)
- Heparin natriumsalt (Sigma-Aldrich H3149-50KU)
- Vid odling av Xenopus 15 / 0 tumörer [se 3 för mer information]: 1 L i Iscove DMEM bassubstratets (Gibco-Invitrogen 11.965) med 10 ml Insulin, 10 ml icke-essentiella aminosyror, 10 ml penicillin-streptomycin, 10 mikrogram / mL Kanamycin, 3 mL primatone (Sheffield Products Division), 1 ml β2-merkaptoetanol och 3,02 g NaHCO 3 i vatten (pH 7,0). Detta medium är utspädd till amfibie osmolaritet genom att lägga till 30% dubbla destillerat vatten, och kompletteras med 5% fetalt bovint serum, 20% superantant från en Xenopus njure cellinje A6, och 0,25% av den normala Xenopus serum.
10. Representativa resultat
Figur 1. Stereomicroscopic analys av huden avstötning 12 dagar efter transplantation. LG-6 klonade grodan fått en hudtransplantation från antingen (a) en MHC-identiska LG-6 (visar inga avslag) eller (B) en MHC-disparata utavlat givaren (80% avslag). Pilar visar silverglänsande iridophore pigmenterade celler märkning friska (icke-förkastas) ympade vävnad. (*) Mark of peang inte beror på avslag.
Figur 2. Gp96 underlättar gränsöverskridande presentation av tumörantigen i Xenopus. LG-15 PL (5 x 10 5) var pulsade i 1 timme på is antingen med APBS (negativ kontroll), 1 mikrogram av rekombinant gp96 renat från en E. Coli kultur, eller 1 eller 0,5 mikrogram av gp96 renas från 15 / 0 tumörvävnad. Efter 3 tvättar har celler adoptively över till LG-15 vuxna mottagare (1 x 10 6 / individ). Tre dagar senare, live 15 / 0 tumörceller (5 x 10 5) vartransplanterade genom subkutan injektion. Varje kurva representerar kinetik av tumörtillväxt i en groda. Dagar efter utmaning när tumörer först dök upp var övervakas och tumörens storlek bestämdes regelbundet med en tjocklek (längd x bredd x tjocklek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den amfibie Xenopus är ett unikt mångsidig icke-däggdjur modell för att studera immunitet. Dess omfattande användning inom biomedicinsk och immunologisk forskning har gett på många viktiga forskningsverktyg som definieras MHC klonerna LG-6 och LG-15 liksom olika cellinjer och monoklonala antikroppar. Med hjälp av dessa verktyg har vi etablerat olika in vitro och in vivo-tester för att studera möjligheterna för heat shock protein som gp96 att medla potenta Ag-specifika anti-moll H-Ag och anti-tumör T svar cell 7. Denna modell gör att vi kan fortsätta undersöka den immunologiska egenskaper gp96 under priming och effektor faser cell.
När det gäller grundning fas inledande studier av dessa svar används subkutan immunisering med renade gp96 som krävs två injektioner av 10 mikrogram gp96 med två veckors intervall innan in vivo-analyser som hudtransplantation eller tumör transplantation 2, 8. I jämförelse är över presentationen metod vi utvecklat 7 och för närvarande använder mer bekväm och effektiv. De många fördelarna med denna grundning strategi inkluderar tid och mängd protein som behövs för varje experiment. Till exempel för att vaccinera ett djur tar det 4 veckor och 20 mikrogram gp96, samtidigt med PL priming behöver vi bara 3 dagar och 0,5 till 1 mikrogram av protein. Dessutom finns det mindre variabilitet eftersom fyllning består av en enda injektion av PL pulsade med gp96. Detta är ett kritiskt steg för om nålen dras ut för snabbt under en av de immunisering genom subkutan injektion, en större del av proteinet kan förloras därför orsaka en större variation. Viktigaste är att kors-presentation assay ett sätt att ytterligare undersöka mekanismerna för gp96-medierade immunsvar. Till exempel kan vi modulera också ett uttryck för vissa molekyler som klass Ia på ytan av PL innan pulserande med gp96 att undersöka deras roll i gp96 medierade immunsvaret och T-cell grundning. Processen med gp96 internalisering kan också studeras genom före inkubering PL med antikroppar eller konkurrenter störa endocytic receptorer 7.
När det gäller effektor fasen är Xenopus modellen inte bara lämplig för att karakterisera immunceller effektenheter in vitro med flödescytometri, dödande och analyser spridning 8, 9, men ger också kraftfulla in vivo såsom mindre H-Ag-olikartade hudtransplantation och tumör transplantation analyser. Båda dessa analyser är väl etablerade i Xenopus modell men det finns några viktiga steg som måste följas. Till exempel i hudtransplantation analysen särskild uppmärksamhet måste ägnas vid hantering av transplantat, särskilt när du klipper ut genom fönstret från överliggande värd hud. Fönstret måste vara något mindre än transplantat sig så att transplantatet inte kommer att falla ut. Vidare under tumör transplantationen är det viktigt att först injicera halva kontroll djuren följt av experimentella ettor och än avsluta med den andra halvan av kontrollen grodor. Detta kommer att säkerställa att tumören är lönsamt under injektionen processen och kommer att producera mer konsekventa data. Det faktum att denna modell systemet bygger på klonade djur gör det möjligt att ytterligare utöka studier av effektor celler stimuleras av hsps använda adoptiv cell överföra 10.
Sammanfattningsvis presenteras de metoder som här lyfta fram grodan Xenopus som en särskild icke-däggdjur modellsystem för att studera hsps som gp96 roll i immunförsvaret övervakning och immunsvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Experten djurhållning som Tina Martin och David Albright är tacksamt uppskattat. Denna forskning har finansierats med bidrag T32-AI-07.285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059.830-06 från NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents needed: | |||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | |||
| NaCl, 1.15 g/L | |||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | |||
| KH2PO | |||
| 10N NaOH | |||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | |||
| Iscove DMEM basal medium | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Insulin | |||
| Non-essential amino acids | |||
| Penicillin-streptomycin | |||
| Kanamycin | |||
| Primatone | Sheffield Products Division | ||
| β2-mercapt–thanol | |||
| NaHCO3 | |||
| 30% double distilled water | |||
| 5% featal bovine serum | |||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | |||
| 0.25% of normal Xenopus serum | |||
| Materials and Equipment: | |||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | |||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD Biosciences | ||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD Biosciences | ||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD Biosciences | ||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD Biosciences | ||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | |||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon BD | ||
| Razor blades | |||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | ||
| 10 cm glass petri dishes | |||
| 9" Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR international | ||
| Tygon tubing | |||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | ||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Helios calipers | |||
| Dissecting microscope | |||
| High intensity illuminator | |||
| Hemacytometer | |||
| Un-bunsen burner | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| Centrifuge |
References
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u, L, Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).
- Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions. Methods. 32, 42-53 (2004).
- Chardonnens, X., Pasquier, D. u, L, Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens. Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).
- Du Pasquier, L., Bernard, C. C. Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus. Differentiation. 16, 1-7 (1980).
- Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method. Transplantation. 83, 159-166 (2007).
- Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).
- Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins. J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).
- Morales, H., Robert, J. In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus. Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).
- Maniero, G. D., Robert, J. Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus. Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).
