Summary
DNA-איזוטופ יציב חיטוט היא שיטת טיפוח עצמאית לזהות ולאפיין הקהילות פעיל של מיקרואורגניזמים המסוגלים ניצול מצעים ספציפיים. הטמעת מצע מועשר באיזוטופ הכבד מוביל התאגדות של אטומים שכותרתו לתוך ביומסה של חיידקים. שיפוע ultracentrifugation צפיפות מאחזר DNA שכותרתו עבור ניתוחים מולקולריים במורד הזרם.
Abstract
DNA-איזוטופ יציב חיטוט (DNA-SIP) היא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי מיקרואורגניזמים פעיל להטמיע מצעים פחמן מסוים וחומרים מזינים לתוך ביומסה הסלולר. ככזה, זו טכניקה טיפוח עצמאית כבר מתודולוגיה חשוב עבור הקצאת פונקציה מטבולית של קהילות מגוונות המאכלסים מגוון רחב של סביבות יבשתי מימיים. לאחר דגירה של המדגם סביבתי עם איזוטופ יציב, תרכובות שכותרתו, חומצות גרעין חילוץ נתונה ultracentrifugation צפיפות שיפוע חלוקה הדרגתי לאחר נפרד חומצות גרעין של צפיפויות שונות. טיהור של ה-DNA של צזיום כלוריד מאחזר שכותרתו תווית ה-DNA לאפיון מולקולרי הבאים (לדוגמה, טביעת אצבע microarrays, ספריות שיבוט, metagenomics). פרוטוקול זה מספק וידאו יופיטר חזותי שלב אחר שלב ההסברים של פרוטוקול עבור שיפוע צפיפות חלוקה ultracentrifugation שיפוע, ושחזור של ה-DNA מסומן. הפרוטוקול כולל גם נתונים מדגם SIP ומדגיש טיפים חשובים מזהיר כי יש לקחת בחשבון כדי להבטיח ניתוח מוצלח SIP-DNA.
Protocol
1. הכנה של ריאגנטים
DNA-SIP מחייב שימוש ריאגנטים כי צריכים להיות מוכנים מראש של ההליך בפועל. הנחיות להכנת כל אחד מגיב המפורטים בסעיף זה שונו מן קודמת SIP פרוטוקול 1.
- צזיום כלוריד (CsCl) פתרון להכנת הדרגתיים SIP - הכן פתרון 7.163 M CsCl בהדרגה על ידי המסת 603.0 גרם של CsCl במים מזוקקים deionized (DDH 2 O) נפח סופי של 500 מ"ל. היזהר שלא יעלה על 500 מ"ל! התחממות הפתרון מעט תוך ערבוב יעזור לפזר כל CsCl. Aliquot הפתרון הסופי aliquots אטום. במעבדה שלנו, מנהג נפוץ הוא אחסון להכין 100 מ"ל aliquots ב 125 מ"ל אמפולות סרום, אשר אז crimp חתום עם פקקים גומי בוטיל. Aliquots אטום ניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל בטמפרטורת החדר (20 ° C). חותמות למנוע אידוי CsCl היווצרות "קרום". קביעת צפיפות של הפתרון על ידי שקילה בשלושה עותקים 100-μL aliquots, או באמצעות refractometer דיגיטלי (למשל רייכרט AR200) כי כבר מכויל בזהירות פתרונות CsCl. מכויל פעם בהצלחה, AR200 רייכרט עקבי ומספק קריאה מדויקת במשך כמה שנים. בטמפרטורת החדר (20 ° C), צפיפות הסופי של פתרון זה בדרך כלל נע 1.88-1.89 גרם מ"ל -1. צפיפות משתנה מעט בכל פעם מלאי חדש מוכן.
- צזיום כלוריד פתרון להכנת מילויים עם ethidium ברומיד (EtBr) - מערבבים 250 גרם CsCl עם 250 מ"ל מים סטריליים של DDH O 2. פתרון זה Aliquot לתוך צלוחיות בסרום נפרד כי כבר crimp חתום עם חותמות גומי בוטיל כמתואר 1.1.
- מאגר הדרגתי - שלב 50 מ"ל של טריס 1 M-HCl, 3.75 גרם KCl ו - 1 מ"ל של 0.5 M EDTA עד 400 מ"ל מים. ממיסים את KCl, ולאחר מכן להוסיף DDH 2 O ל 500 מ"ל. מסנן לעקר ו החיטוי. הפתרון הסופי הוא 0.1 M טריס, 0.1 M ו 1 KCl mM EDTA.
- פוליאתילן גליקול (PEG) פתרון - הכינו את הפתרון PEG ידי המסת 150 גרם של פוליאתילן גליקול 6000 ו - 46.8 גרם של NaCl ב סטרילי מים DDH O 2 כדי בהיקף כולל של (PEG 30%, 1.6 M NaCl) 500 מ"ל. החיטוי.
הערה: פתרון זה מפריד לשני שלבים עם מעוקר. כלול בר ומערבבים בבקבוק autoclaved כך שהפתרון יכול להיות מעורב כראוי כאשר זה מתרחש. - TE הצפת - הכן פתרון של 10 mM טריס-HCl (pH 8.0) ו 1 mM EDTA (pH 8.0) ב סטרילי מים DDH O 2, באמצעות פתרונות מניות autoclaved של טריס 1 M-HCl (pH 8.0) ו - 0.5 M EDTA ( pH 8.0). סנן לעקר ו החיטוי.
- אתנול 70% - שלב 350 מ"ל של אתנול הטוהר גבוהה עם 150 מ"ל מים סטריליים של DDH O 2.
2. לדוגמה דגירה Extraction ו-DNA
עבור ה-DNA SIP incubations, דגימות מודגרת בדרך כלל עם איזוטופ פחמן כבד (13 C) המצע. תקופות דגירה והתנאים (כגון תוספי תזונה, לחות, אור) ישתנו בהתאם לסוג מדגם זה מודגרות ואופי המצע. DNA-SIP הניסויים התבצעו בהצלחה באמצעות מגוון של תרכובות פחמן חד 2,3, רב תרכובות פחמן 4,5,6, וכן באמצעות חנקן שכותרתו 7,8 או חמצן 9. עם זאת, החיסרון באמצעות N-15 או 18 O-שכותרתו תרכובות הוא ההפרדה הפיזית ירידה של חומצות גרעין שכותרתו, בעיקר בשל נוכחות של חנקן פחות אטומי חמצן ב-DNA ו-RNA יחסית אטומי פחמן.
פקד קריטי עבור ה-DNA SIP הניסויים הוא זהה הדגירה הוקמה עם המצע (למשל 12 C) הילידים. הדגירה זה מספק השוואה הבאים על מנת להבטיח כי כל תיוג לכאורה של חומצות גרעין לא היה תוצר של ultracentrifugation או G + C צפיפות תוכן הבדלים ב-DNA לתרום הפרדה 10. חשוב גם לשמור על חומר מדגם קפוא לעומת 'אור' ו-DNA "כבדה", וכדאי כולל שליטה ללא מצע להעריך האוכלוסייה רקע שינויים לאורך הדגירה ה-SIP.
- דגירה דגימות סביבתיות ב מיקרוקוסמוס המכיל מצע שכותרתו (איור 1). מניסיוננו, מצאנו כי שילוב מינימום של בין 500-500 μmol של פחמן C 13 לגרם של המדגם יהיה מתאים דגימות המכילות ביומסה גבוהה כגון דגימות קרקע 1. לקבלת דוגמיות מימיים המכיל ביומסה פחות קרקעות, 100-100 μmol של שולבו 13 פחמן C לליטר עשוי להניב חתימה לזיהוי איזוטופים כבדים 1. סכום התיקון פחמן, חלקם של פחמן שולבו ביומסה דרישה בנוסף מזין משלים עבור הטמעה יהיה תלוי את המאפיינים של דגימות להיות מנותח ואת o ממוקדrganisms של עניין. קבוצה אחת של הנחיות הדגירה מדגם לא יהיה ישים עבור כל הדגימות. חשוב לציין, ריכוז המצע המשמש הדגירה SIP אידיאלי צריך להיות קרוב ככל האפשר לריכוז נתקל בדרך כלל באתרו; הטיה הניסוי עשוי להיות תוצאה של תרבות תנאים העשרה 10.
- לאחר דגירה של המדגם עם המצע איזוטופ יציב, שכותרתו, לחלץ דנ"א מיקרוקוסמוס באמצעות פרוטוקול קפדני החילוץ (עבור ה-PCR או שיבוט להכניס קטנה) או תמוגה האנזימטית מהימן עבור שיבוט משקל מולקולרי גבוה (למשל גדול להכניס metagenomics). RNA שיתוף החילוץ בדרך כלל אינו משפיע על הניתוח, ולכן פרוטוקולים תשואה RNA, כמו גם ה-DNA עשויה לשמש. Ultracentrifugation של ה-DNA חילוץ לא גזירה שברי קצר יותר מאשר זוגות ~ 50 kb 1.
- לכמת DNA חילוץ לפני ההתקנה של צינורות ultracentrifugation CsCl הדרגתי. לכמת דנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר (למשל Nanodrop 2000) אם פרוטוקול מיצוי התשואות רק ה-DNA (למשל טור מבוססי ערכות). לחלופין, לכמת באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose.
3. הכנת פתרונות עבור Gradient ultracentrifugation
הליך זה כרוך הוספת ה-DNA כדי ultracentrifuge צינורות. יש יותר מסוג אחד של הצינור ואת הרוטור כך פרוטוקול מדויק ישתנה ויהיה תלוי בהוראות היצרן. עם זאת, אנו ממליצים על השימוש רוטור אנכי היטב כדי להבטיח הפרדה המרבית האפשרית של ה-DNA קל וכבד. אנו משתמשים Beckman Coulter-Vti 65.2 הרוטור עם 16 בארות מחזיק 5.1 מ"ל צינורות QuickSeal Polyallomer ופרוטוקול יספק את הפעולות ושיקולים עבור תנאים אלה.
- באמצעות ריכוזים DNA נקבע בשלב 2.3, לחשב את נפח נדרש חילוץ של ה-DNA הנדרש כדי לספק 0.5 מיקרוגרם - 5 מיקרוגרם של ה-DNA של צינורות ultracentrifuge.
- שלב ה-DNA חילוץ (0.5-5 מיקרוגרם) עם הצפת צבע (ראה שלב 1.3) ו 4.8 מ"ל של 7.163 M CsCl כדי בהיקף כולל של 6 ~ מ"ל צינור סטרילי 15 מ"ל הפנויה. ראוי לציין, כי צפיפות של הפתרון CsCl יכול להשתנות אפילו molarity זהה (ראה שלב 1.1). המשוואה הבאים יכולים לשמש כדי לקבוע את עוצמת הקול של תערובת צבע מאגר / DNA הנדרש כדי ליצור יחס ערבוב המתאים:
חוצץ ו-DNA Gradient פתרון נפח (מ"ל) = (פתרון CsCl מניות צפיפות - צפיפות הסופית הרצויה) x נפח פתרון מניות CsCl הוסיף 1.52 x
ציין את נפח פתרון מניות CsCl ב 4.80 מ"ל. הצפיפות הסופית הרצויה צריכה להיות 1.725 גרם מ"ל -1. צפיפות הפתרון המניה נקבע בשלב 1.1.
שים לב גם כי כמויות היחסי של CsCl ו Gradient מאגר / DNA תגרום נפח משולב של יותר מ 5.1 מ"ל. הכנת אמצעי אחסון גדול יותר קיבולת נפח מרבי של צינורות ultracentrifuge (יותר מ 5.1 מ"ל) יבטיח כי יש פתרון מספיק כדי למלא לגמרי את הצינור. - מערבבים על ידי 10 פעמים היפוך. DNA הוא יציב בטמפרטורת החדר CsCl.
4. יצירת צבע לשלוט EtBr (אופציונלי)
מכיוון EtBr היא לצבוע intercalating כי קומפלקסים עם ה-DNA שהופך אותו גלוי תחת אור UV, מילויים לשלוט המכיל EtBr מועילים משום שהם מספקים אישור ויזואלי מיידי על היווצרות צבע לפני חלוקה של צינורות מדגם (למשל איור 1). הכללתו של צינור המכיל בקרה EtBr ואת תערובת של שניהם DNA-C 12 ו - 13 C-DNA (או 14 N-DNA ו 15 N-DNA) המאפשר הדמיה מיידית של היווצרות הלהקה בתוך הצינורות עם השלמת ultracentrifugation. זה חשוב כי צינור מקרע במהלך ultracentrifugation או מצבים מתוכנתים לפעול כראוי עלול לגרום להיווצרות צבע נכשל. Bound ל-DNA, EtBr מוריד את הצפיפות של ה-DNA, וכתוצאה מכך, פרוטוקול שונה לאחר מכן להכין הדרגתיים. שים לב אחר כתמי חומצות גרעין יכול לשמש במקום EtBr 11 אבל הפרוטוקול ידרוש אופטימיזציה עם fluorophores אחרים.
- שיפוע לשלוט דורש שני כרכים של הדנ"א הגנומי: האחד שכותרתו מלא עם איזוטופ יציב, אחד בלי תווית. אנחנו בדרך כלל משתמשים או meliloti Sinorhizobium תרבותי בתקשורת המכיל 13 או C-12 C-גלוקוז כמקור פחמן יחיד, או Methylococcus אמבט capsulatus זן בתרבית בנוכחות של C-13 או C-12 מתאן כפקדי שלנו.
- שלב 5 כמות -10 מיקרוגרם של שני 12 C-13 C-DNA ו-DNA עם הצפת צבע לנפח סופי של 1.00 מ"ל של צינור חד פעמי בורג מכסה של 15 מ"ל.
- הוסף 1.00 גר 'של CsCl מוצק צינור זהה. מערבבים על ידי היפוך.
- הוסף 110 μlפתרון של 10 מ"ג ו -1 מ"ל EtBr 4.3 מ"ל של פתרון 1 גרם מ"ל CsCl -1 המניות הצינור בורג מכסה אותה משמש בשלב 4.2. הצפיפות הסופית של הפתרון יהיה פתרון משוער של המניה המקורי CsCl.
- נוסף פתרון "ריק" שליטה המכיל EtBr יהיה גם נדרש לאזן את הפתרון שיצרת בשלב 4.4. שלב 1.00 מ"ל של הצפת צבע, 1.00 גרם של CsCl, 110 μl של פתרון 10 מ"ג ו -1 מ"ל EtBr 4.3 מ"ל של פתרון 1 גרם מ"ל CsCl -1 המניות צינור 15 מ"ל נפרד בורג מכסה ומערבבים על ידי היפוך.
5. Ultracentrifugation
- בעזרת פיפטה פסטר הנורה, בזהירות למלא צינורות ultracentrifuge עם פתרונות הדרגתיים מוכן בשלב 3.2 (או 4.4 צעדים אם הכנת שיפוע לשלוט EtBr). בזהירות להוסיף את פתרונות הצינורות בעזרת פיפטה פסטר. לייבל הצינורות על הכתף צינור עם סמן קבע בסדר. זהירות: ודא צינורות מלאים בדיוק בבסיס הצוואר הצינור. צינורות מלא לא מספיק נוטים להתפוצץ במהלך ultracentrifugation.
- כאשר כל הצינורות הנדרשים מלאים פתרונות לדוגמה, להקליט את המסה המדויקת של כל צינור. זוג צינורות לאזן אותם בתוך 0-10 מ"ג. לצורך איזון, למצוא זוגות מתאימים כמעט להוסיף או להסיר כמויות זעירות של פתרון עד שהם מאוזנת, תוך שמירה על רמת פתרון קרוב לבסיס של צוואר צינור האפשרי. שים לב כי עבור במשקל צינורות, אנו משתמשים הפוכה 15 מ"ל בורג מכסה הצינור נחתך במחצית כבעלת צינור לאיזון.
- חותם את הצינורות באמצעות "צינור צילינדר" על פי הוראות היצרן.
- בדוק את צינורות סגורים כראוי על ידי היפוך אותם הפעלת לחץ מתון. לשקול שוב את הצינורות כדי לבדוק שהם עדיין מאוזנת לאחר איטום אל תוך 0-10 מ"ג.
- בדוק כל הרוטור היטב בקפידה כדי להבטיח בארות הם נקי של פסולת או אבק העלול לנקב את צינורות במהלך ultracentrifugation.
- הכנס את צינורות לתוך הרוטור עם זוגות מאוזנת מול זה. הקלט את מיקום הרוטור של מדגם זה, כי תהליך ultracentrifugation יכול לגרום תוויות סמן להיות פגום או נמחק. בזהירות לאטום את בארות הרוטור כפי שצוין על ידי היצרן.
- טען את הרוטור לתוך ultracentrifuge. סגור את הדלת ultracentrifuge ולהחיל ואקום. אם אתה משתמש הרוטור 65.2 Vti, לקבוע את מהירות הסיבוב ל 44,100 סל"ד (~ 177,000 XG av), את הטמפרטורה ב 20 ° C, ו ultracentrifugation הזמן 36-40 שעות. בחר ואקום האצה מרבית, לכבות את הבלם (שיפוע מבטיח לא שיבשו על ידי האטה). שים לב כיבוי בלם יוסיף תוספת 1-2 שעות זמן לרוץ. כמו כן שים לב כי פעמים לרוץ קצר לא יכול להשיג רזולוציה הלהקה מספיק. פועל ultracentrifugation ארוך מומלץ, כפי שהם להוביל ברזולוציה גדולה יותר של להקות שונות חומצות גרעין.
- מיד עם השלמת תהליך ultracentrifugation, להסיר את הרוטור בזהירות. להימנע מכל הטיה או מתנגשות של הרוטור, בעדינות להסיר צינורות מן הרוטור כדי למנוע הפרעה הדרגתיים בתוך הצינורות. במקרים נדירים, צינור יתפוצץ בזמן הריצה. אם כך, יש סיכוי כי הדרגתיים בתוך צינורות אחרים לא טופס כמו שצריך. אם שיפוע השליטה נכלל, לבדוק את זה בזהירות צינור תחת אור UV לאשר הקמת הדרגתי. אם השיפוע לא יצרה כראוי בצינור מלאה, עדיף לחזור על כל שלב 5. שים לב כי הצינור EtBr בקרה ושליטה ריק שלה עשוי להיות מאוחסן בחושך ולעשות בהם שימוש חוזר לתקופה של עד שישה חודשים. תשמרי על עצמך כדי לנקות את הרוטור בקפידה על פי הוראות היצרן פעם את הצינור התפוצץ הוסר. אין להשתמש מברשות מתכת או חומרי ניקוי חריפים כדי לנקות בארות הרוטור כדי למנוע שריטות על בארות הרוטור! רוטור ספציפי מברשות תמיסת הניקוי ניתן לרכוש Beckman.
6. צבע ההיפוך חלוקה
קיימות שתי שיטות המשמשות כיום לשחזר את ה-DNA מן הצינורות ultracentrifuge: חלוקה והוצאה מחט. פרוטוקול זה יהיה רק לתאר את התהליך של הפקת DNA באמצעות טכניקה חלוקה. הסיבה לכך היא כי עבור רוב הניסויים SIP, שכותרתו DNA לא ניתן דמיינו עם EtBr ויש במקום להיות מזוהה על ידי השוואת אור שוות ערך שברים כבדים מדגם צינורות מרובים. משאבת מזרק מומלץ מאוד לאחזר שווה שיפוע שברים צפיפות משפופרות ultracentrifuge. אנו משתמשים במודל BSP משאבת עירוי (Braintree Scientific Inc). משאבה נמוכה זרימת peristaltic או משאבת HPLC עשוי לשמש גם.
- ממלאים מזרק סטרילי 60 מ"ל עם סטרילי DDH 2 O המכיל מספיק צבע כחול bromophenol לספק צבע כחול כהה. הנח את המזרק בזרוע העמסה של משאבת מזרק. צרף בצינור המשאבה מצויד במחט 23-מד "1 ולהדליק את המשאבה עד כמה 2 DDH O הגיע עד סוף הערה מחט. שכל בועות האוויר הזה אספקת 2 O DDH ישפיע לרעה את תהליך הפירוק.
- תקן אחד הצינורות ultracentrifugation לעמוד מלחציים. ודא מהדק הוא חזק מספיק כדי למנוע את הצינור מלהיות העקורים, אך לא כך הלחץ על הצינור יגרום לשחרור של פתרון CsCl כאשר הצינור הוא פירסינג. פירס התחתון מאוד של הצינור לאורך התפר שפופרת באמצעות מד טריות 23 1 "מחט. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לנקב את הצינור באופן מבוקר, מהיר ובטוח. זה קשה מאוד לעשות היטב, לתרגל כמה פעמים לפני זהו ניסיון ראשון עם דוגמיות.
- עבור כל דגימה, להכין 12 סטרילי 1.5 microcentrifuge צינורות מ"ל עם תוויות המציין את מספר המדגם חלק (1-12; כבד לאור). באמצעות המחט מחוברת בצינור המשאבה (שלב 6.1), לנקב את החלק העליון של הצינור על הכתף הצינור העליון, לאורך קו התפר. אסוף את פתרון הדרגתי באמצעות צינורות microcentrifuge. ביצע באשר התחתון של הצינור, לנקב את הצינור בצורה מהירה ומבוקרת. עיסוק מראש ולהיזהר מאוד לשימוש תנועת משיכה מבוקר כדי למנוע את המחט נאלץ לעבור דרך הצינור לתוך אצבע! השתמש שיעור משאבת מכויל בעבר כי תניב 12 x 425 μl שברים ב 12 דקות (425 דקות μl -1).
- השתמש refractometer דיגיטלי (למשל רייכרט AR200, מומלץ) או איזון אנליטי כדי לבדוק את צפיפות שברים של שיפוע אחד לאשר הקמת שיפוע מתאים. יהיה עליך להשתמש ~ 50 μl של המדגם לבדיקה זו. לעתים קרובות אנו כוללים DNA תרבות טהורה שפופרת אחת (כמתואר להכנת הדרגתיים לשלוט EtBr) לשמש מלאה עבור חלוקה ולהשתמש לקביעת צפיפות. צפו לצפיפות אל ~ נע בין 1.690-1.760 גרם מ"ל -1, עם צפיפות החציוני של ~ 1.725 גרם מ"ל -1.
7. ה-DNA רטיבות
- המשקע דנ"א שברים בכל תחילה הוספת 20 מיקרוגרם של polyacrylamide ליניארי כנשא של משקעים. מערבבים על ידי היפוך. הוסף 2 כרכים של פתרון PEG (ראה שלב 1) ומערבבים על ידי היפוך. שים לב נשאית של משקעים (גליקוגן למשל או polyacrylamide ליניארי) היא קריטית עבור התאוששות כמותי של ה-DNA מן הפלגים הדרגתי, אבל זהירות יש להשתמש אם הגליקוגן משמש כנשא של משקעים עבור פרוטוקול זה. ההכנות גליקוגן הוכחו להיות מזוהמים עם חומצות גרעין חיידקים זיהום יכול בקלות לבלבל את הפרשנות של שברים SIP שיפוע 12.
- השאירו את צינורות בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות, כדי לאפשר את ה-DNA כדי לזרז. אם תרצה, צינורות אפשר להשאיר למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה ב 13,000 גרם במשך 30 דקות עם הגב של צינורות פונה החוצה עבור אוריינטציה צינור עקבית הרוטור. בזהירות לשאוב ולהיפטר supernatant. גלולה צריך להיות גלוי אבל יכול להיות מאוד קשה לראות בשלב זה. עבודה תחת מקור אור חזק (למשל, מנורת השולחן) כדי לסייע לדמיין את כדורית.
- שטפו את הכדור עם 500 μl של אתנול 70%. צנטריפוגה ב 13,000 גרם במשך 10 דקות. בזהירות לשאוב ולהיפטר supernatant. גלולה יהיה בדרך כלל גלויים יותר בשלב זה, אלא לנתק מהקיר צינור בקלות רבה יותר.
- אפשר גלולה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- להשעות כל גלולה של 50 μl של TE חיץ (ראה שלב 1.5). הפעלה 5 μl של כל חלק על ג'ל agarose על פי פרוטוקולים במעבדה סטנדרטית.
8. שבר אפיון
שיטת לאפיין שברים הדרגתי על מנת להעריך את הצלחת הדגירה SIP ישתנו בהתאם במעבדה וזמינות של ציוד. באמצעות שיטת טביעת אצבע עבור מיקוד הגן 16S rRNA היא גישה משותפת שיטות כגון פולימורפיזם הגבלה מסוף אורך קטע (T-RFLP) או ג'ל אלקטרופורזה denaturing שיפוע (DGGE) מתאימים (איור 1). בעקבות פרוטוקול המתואר לעיל, לצפות את ה-DNA לאור להיות מזוהה עם שברים 9-11 (~ 1.705-1.720 גרם מ"ל -1) ואת טביעות DNA כבד להיות מזוהה בתוך שברים 5-8 (~ 1.720-1.735 גרם מ"ל -1 ). טביעות אצבעות ייחודיות הקשורות שברים של 5-8, איזוטופ יציב דגימות מודגרות, אך לא עם המצע ילידים שולטת מודגרות מספק ראיות מוצקות לקשר אורגניזמים ספציפיים עם חילוף החומרים של המצע שכותרתו בפרט. אם ה-DNA שכותרתו נשאר מספיק עבור יישומים מסוימים (metagenomics הכלאה), הגברה עקירה מרובות ניתן להשתמש כדי לייצר כמויות יותר 13-15 אבל זה יכול להכניס לתוך ה-DNA מפלצות מוגבר 14,16.
"Jove_title"> 9. תוצאות
אופיינית-DNA SIP תוצאות תדגים הפרדה של דנ"א שכותרתו תווית של שיפוע שהוקמה על ידי ultracentrifugation. באופן אידיאלי, ברזולוציה מלאה של החומר הגנטי משקל מולקולרי גבוה (למשל 13 C, 15 N) מחומרים תווית יושג. החלטה יכולה להיות עדים חזותית על ידי התבוננות במבנה הלהקה צינורות EtBr שליטה. ריכוזים של הדנ"א הגנומי לאחזר הכלול שברים שיפוע הפרט עשוי לשמש גם כדי לאשר את היווצרות שיפוע מתאים.
עבור פרוטוקול זה, אנו כוללים את תוצאות נציג ultracentrifugation שיפוע שבוצעו באמצעות חומצות גרעין של שתי תרבויות טהור (איור 2). שיפוע מופרדים כללו כאן הוכן באמצעות הדנ"א הגנומי המופקים ס meliloti (ATCC 1021), ו - 13 C-שכותרתו מ str capsulatus. אמבט. לאחר התאוששות, ultracentrifugation חלוקה ו-DNA, שכותרתו תווית הדנ"א הגנומי נפרדות שברים הדרגתי בהתאמה עם צפיפויות שונות (איור 2 א). Heavy-DNA מסומן האיזוטופ ניתן לראות שברים 4-5, בעוד ה-DNA תווית נמצא בריכוזים גבוהים שברים 9-10. הדנ"א של כל חלק התאפיין עם ג'ל אלקטרופורזה denaturing שיפוע 17 ו PCR-הגברה מוצרים שנוצרו דפוסי פסים בדידים המתאימים שני אורגניזמים כלול שיפוע (איור 2B). צפיפות שברים נע בין ~ 1.580-1.759 גרם מ"ל -1, והם מוצגים לפי סדר יורד צפיפות משמאל לימין.
למרות ההפרדה של 13 טהור C-12 ו-C-DNA יכול להיות מבוטא (איור 2), incubations מדגם סביבתיים עשוי להיות קשה יותר לפרש. לדוגמה, אנו מודגרות הטונדרה קרקעות מן רזולוט ביי (נונאווט, קנדה) עם גלוקוז או C-12 C-שכותרתו או 13 לתקופה של 14 יום על 15 ° C. Agarose ג'לים של דנ"א מטוהרים חלק שיפוע הראו כי הדנ"א הגנומי היה "נמרח" על פני שברים 7-10 הן 12 ו - C-13 C-incubations (איור 3A ו - 3C, בהתאמה). במקרה זה, 13 C-העשרה של ביומסה של מינים של חיידקים מסוים יכול להיקבע רק עם גישה כמו DGGE של גנים 16S rRNA. 12 C-DNA גלוקוז אדמה מודגרות יוצרת דפוסים דומים בכל שברים הדרגתי (איור 3B), אבל 13 מדגם C-גלוקוז מודגרות שנוצר טביעות אצבעות DGGE המשויכים באופן ייחודי עם שברים 5-8 (איור 3D). מעניינת במיוחד הן להקות נשמרת מסומן על ידי החצים. זה "phylotype" דומיננטי עקבי לאורך כל שברים הדרגתי אך עוברת שברים כבדים עבור DNA המתקבל אדמה C-גלוקוז 13 מודגרות. לאחר רצף ה-DNA של הלהקה ו / או לשכפל ניתוח ספריית היה לוודא את זהותו של הגן הזה rRNA 16S בפרט מדריך metagenomic הבאים או גישות טיפוח המבוססים.
באיור 1. תמציתי של ניסוי ה-DNA SIP שכלל מדגם הדגירה, מיצוי DNA, ultracentrifugation CsCl שיפוע צפיפות ואפיון DNA בטכניקות מולקולריות.
איור 2. תוצאות צפויות עבור חלוקה שיפוע SIP, כולל ה-DNA של שתי תרבויות טהור. (א) Aliquots של דנ"א שברים שיפוע 1-12 נוהלו על 1% agarose ג'ל מתוך שיפוע המכילה 13 C-שכותרתו מ capsulatus אמבט זן (שברים 4-6) ו-C-12 שכותרתו ס meliloti (שברים 80-10). סולם 1-kb נכלל לצורך השוואה (ב) PCR-DNA מוגבר של שברים באותו נוהלו על ג'ל DGGE 10%. דפוסי טביעות אצבע לגלות הבדלים ברורים בין שברים 5 ו - 9, למשל.
איור 3. תוצאות צפויות עבור fractionations SIP הדרגתי מ incubations דגימת קרקע. Aliquots של שברים שיפוע מהקרקע הן C-גלוקוז 12 מתוקן (א) ו - 13 C-גלוקוז אדמה מתוקן (ג) היו לרוץ על 1% agarose ג'לים סולם 1-kb נכלל להשוואה. טביעות אצבעות DGGE מקבילים עבור כל אחד מדגמים אלה מוצגים (B) (D). טביעת אצבעות של שברים מגלה העשרה מינים של חיידקים מסוימים מדגם C-13 גלוקוז תוקן שברים 08/05 (ד ').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תכנון נכון של איזוטופ יציב ניסויים חיטוט היא בעלת חשיבות מכרעת לקבלת DNA שכותרתו לעיל הקהילה רקע תווית. שיקולים הקשורים מדגם פעמים הדגירה, ריכוז המצע, תנאי הדגירה (חומרים מזינים כגון לחות תוכן אדמה), בין האכלה שכפול נדונו במקום אחר 10,18 ו - אנו ממליצים להתייעץ עם הקורא פרסומים אלה בעת תכנון הדגירה SIP. לגבי הפרוטוקול הנוכחי, ראוי להעיר על שיקולים נוספים הקשורים הפרשנות של נתוני ה-SIP הדרגתיים. בשל אופיו של תהליך ultracentrifugation, חשוב לכלול בנוסף שולטת כגון תרבויות טהור המצע ילידים דגימות מודגרות על מנת להבטיח כי להקות להופיע או להיעלם שברים מסוימים אינם חפצים של הפרוטוקול עצמו. לדוגמה, ה-DNA בתוך שיפוע ultracentrifuge לא יכול להיות גלוי ג'ל agarose (איור 2 א), אך עדיין עשויים לזהם את אורכו של מדרון (איור 2B). למרות מ דפוסי capsulatus ברורים ביותר שברים צפופה (5-7) של הג'ל שמוצג באיור 2B, דפוס DGGE זהה נצפתה עדיין בשבריר הקל (12). עם בקרות לשקול בזהירות, הפרשנות של שבריר נתונים SIP שיפוע אפשרי.
בשל אופיו של כמה מעוצב היטב ניסויים SIP (למשל ליד בריכוז המצע באתרה, פעמים הדגירה קצר), שילוב איזוטופ יכול להיות נמוך מאוד 10. בנוסף, רוב מיקרואורגניזמים בסביבות יבשתי או מימיים דור יש פעמים רב לעומת הגידול במעבדה, דורשים פעמים דגירה ארוכה כדי להגיע לגילוי רמות של העשרת איזוטופים. אוכלוסיות נוספות יכולות להיות מסוגל חילוף חומרים מגוון מצעים, ועשוי לא להיות לגדול באופן מלא על מצע שכותרתו. יש גם קהילות (כגון מי תהום), אשר עשויה להיות קשורה עם רמות נמוכות ביומסה מניבות תשואה נמוכה של חומצות גרעין חילוץ. בכל המקרים הללו, אחזור כמותית של חומצות גרעין שכותרתו עשויה להיות מאתגרת.
כדי לעקוף את המגבלות האלה, מגוון רחב של מולקולות נושאת טבעיים וסינתטיים קיימים המסייעים המשקעים ושחזור של ה-DNA מן הדרגתיים CsCl. מולקולות המוביל יכול להיות ביולוגי ממוצא כגון גליקוגן או דנ"א אורגניזם archaeal 19, או סינתטי בטבע, כגון polyacrylamide ליניארי. היתרון של שימוש במולקולות המוביל כגון אלה בעת ביצוע ה-DNA SIP הוא שהם יכולים לאפשר ויזואליזציה של להקות ב הדרגתיים CsCl כי בדרך כלל לא יהיו גלויים ולהבטיח התאוששות כמותית של ריכוזי ה-DNA נמוכה. לשחזור מוצלח של Nanogram כמויות נמוכות של דנ"א הדרגתיים CsCl למעשה מחייב שימוש של מולקולת 1,12 המוביל. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי מולקולות נושאת ממקורות ביולוגיים יכול לעתים קרובות להיות מזוהמים עם ה-DNA מן האורגניזם מקור 12 והתוצאות קשה מאוד להבחין בין דפוסי הדנ"א הקשורים C-שכותרתו 13 (מידע לא מוצג). לכן מומלץ כי מולקולות סינתטיות המוביל כגון polyacrylamide ליניארי לשמש עבור ה-DNA SIP. בנוסף, השימוש הגברה מרובות עקירה (מד"א) יכול לייצר תשואות איכות גבוהה של ה-DNA שכותרתו עבור ניתוחים מולקולריים במורד 13,14, למרות מפלצות עשוי להיות שנוצר על ידי הגברה ו זוהה מנתח מולקולרית במורד 14.
אחד היישומים החזקים ביותר של ה-DNA-SIP שטרם ניתן לנצל באופן מלא את ההתאוששות הוא הפוטנציאל של ה-DNA של חברי הקהילה הפעילים לניתוח ספריה metagenomic. אנו צופים כי התקדמות גדולה בגילוי האנזים תגרום מן שילוב של איזוטופ יציב, תוך חיטוט סקרים metagenomic הקיים מסביבות יבשתי ימיים מגוונים. פרוטוקול דמיינו כאן יהיה לייצר DNA שכותרתו באיכות מספיק אלה גילוי יישומים מבוססי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט אסטרטגי ומענקים דיסקברי JDN מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
| Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR international | CAPX1286L-4 | |
| Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
| Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
| Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
| Tube sealer | Equipment | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| Ultracentrifuge | Equipment | Beckman Coulter Inc. | ||
| Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman Coulter Inc. | 362754 | |
| Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
| Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
| Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Centrifuge tubes | Material | Beckman Coulter Inc. | 342412 | |
| Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD Biosciences | 305145 | |
| Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
| Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
| Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
| Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Syringe, 60 mL | Material | BD Biosciences | 309653 |
References
- Neufeld, J. D. DNA stable-isotope probing. Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).
- Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).
- Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).
- Padmanabhan, P. Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).
- Bernard, L. Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques. Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).
- Haichar, elZ. ahar, F, Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing. Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).
- Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients. J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).
- Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).
- Schwartz, E. Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).
- Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology. Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).
- Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays. J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).
- Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant. Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).
- Chen, Y. Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands. Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).
- Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics. Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).
- Kalyuzhnaya, M. High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities. Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2, 233-241 (2008).
- Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).
- Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age. ISME J. 1, 103-110 (2007).
- Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing. Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.
