Summary
موصوفة تلفيق قنوات ميكروفلويديك وتنفيذها في تجارب لدراسة السلوك الكيميائي تستخدم علفا للميكروبات البحرية داخل المغذيات الطبيعية البرية والبحرية وسلوك غير مكتمل للسباحة داخل البكتيريا تدفق القص.
Abstract
والدرجة التي يمكن أن تستغل الميكروبات العوالق بقع الموارد الميكروسكيل لها آثار كبيرة للالديناميكية المحيطية والتمويه البيوجيوكيميائية. ومع ذلك ، للاستفادة من بقع المغذيات في المحيطات ، والميكروبات السباحة يجب التغلب على تأثيرات القوى المادية بما في ذلك نشر الجزيئية والقص المضطربة ، والتي سوف تحد من توافر بقع وقدرة البكتيريا على العثور عليهم. حتى وقت قريب ، قد حالت دون قيود المنهجية الفحوص الجرثومية المباشرة للسلوك داخل الموائل غير متجانسة وواقعية ظروف التدفق على نطاق صغير. وبالتالي ، فقد تم شراء الكثير من معرفتنا الحالية بشأن السلوك الميكروبي في المحيط من التنبؤات النظرية. للحصول على معلومات جديدة عن السلوك تستخدم علفا للميكروبات في المحيطات لدينا تطبيق تقنيات التصنيع لينة الطباعة الحجرية لتطوير أجهزة ميكروفلويديك 2 ، والتي استخدمناها لإنشاء (ط) الميكروسكيل بقع المغذيات ذات أبعاد وخصائص ناشر ذات الصلة لعمليات المحيطات والميكروسكيل (II) الدوامات ، مع معدلات مماثلة لتلك القص المتوقع في المحيط. وقد أتاحت هذه الأجهزة ميكروفلويديك الفحص الاول المباشر للسباحة الميكروبية والسلوك الكيميائي داخل المناظر البحرية غير المتجانسة والحيوية. الجمع بين استخدام والتخلص epifluorescence المجهري المقابل تسمح الامتحانات مباشرة للأبعاد المادية والخصائص ناشر من بقع المواد الغذائية ، مع مراعاة استجابة حصري على مستوى السكان ، بالإضافة إلى السلوك الفردي للسباحة الميكروبات. وقد كشفت هذه التجارب أن بعض أنواع العوالق النباتية والبكتيريا متغايرة والأولانيات ابتلاعي التغذي بارعون في تحديد مكان واستغلال الموارد الميكروسكيل بقع نشرها ضمن أطر زمنية قصيرة جدا. أظهرنا أيضا أن تصل إلى معدلات معتدلة القص ، والبكتيريا البحرية قادرة على مكافحة تدفق والسباحة من خلال بيئتهم في تلقاء نفسها. ومع ذلك ، ما وراء القص مستوى عتبة عالية ، تتماشى البكتيريا في تدفق القص وأقل قدرة على السباحة من دون إزعاج من التدفق. على microfluidics يمثل نهجا جديدا وغير مكلفة لدراسة البيئة المائية الميكروبية ، ونظرا لمدى ملاءمتها لخلق مجالات تدفق بدقة واقعية والتدرجات الركيزة في microscale ، ينطبق بشكل مثالي لامتحانات السلوك الميكروبية في موازين أصغر من التفاعل. ولذلك نقترح على microfluidics يمثل أداة قيمة للحصول على فهم أفضل لإيكولوجيا كائنات دقيقة في المحيط.
Protocol
إعداد
1. إنشاء قناع
باستخدام برامج CAD ، تصميم قناة للطباعة عالية الدقة على الشفافية. وسوف يكون هذا "قناع".
في غرفة نظيفة :
2. خبز نظيفة والرقاقة
أولا ، بخ الرقاقة مع الأسيتون ، ثم سرعان ما مع الميثانول ، ثم مع الأيزوبروبانول. أخيرا ، الجافة الرقاقة باستخدام النيتروجين.
خبز الرقاقة في الفرن (130 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
3. طلاء الرقاقة
وضع رقاقة في مركز للآلة تدور طلاء. من أجل مقاومة للضوء (SU - 8) من الزجاجة على الرقاقة. السماح لتدفق SU - 8 والاسترخاء لS. 10 ~ بدوره على المغطي الجانبية وتصل سرعته المنحدر 0-500 دورة في الدقيقة ما يزيد على 5 في الثانية ؛ الاحتفاظ ب 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية ؛ منحدر يصل إلى السرعة النهائية على 10 ثانية وتحافظ على السرعة النهائية لمدة 30 ثانية. سرعة النهائي يعتمد على سماكة طبقة المستهدفة وSU - 8 المستخدمة. ويمكن الاطلاع على التفاصيل في http://www.microchem.com/
4. لينة خبز
بعد طلاء الرقاقة ، خبز لأول مرة في 65 درجة مئوية ، ثم في 95 درجة مئوية. الوقت يختلف مع الخبز سمك المستهدفة ونوع من مقاومة للضوء المستخدمة. ثم ، والسماح للرقاقة الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على الأقل.
5. تعرض
وضع قناع على رأس رقاقة وفضح الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية في الوقت الموصى به في دليل SU - 8.
6. بعد التعرض للخبز
خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية و 95 درجة مئوية ثم بعد SU - 8 في دليل التعليمات.
7. تطوير رقاقة للحصول على "سيد" (القالب)
إعداد كوب مملوء المطور (PMMA). تزج الرقاقة في الدورق بلطف جدا بينما تتأرجح الدورق حتى يتم غسلها جزء غير معلن من مقاوم الضوء بعيدا.
في مختبرنا :
8. إعداد PDMS وسكبه على الرقاقة
مزيج PDMS مع وكيلها في علاج نسبة 10:01 في فنجان. ويحرك مزيج متجانس فإنه : هذه سوف تولد الكثير من الفقاعات وجعل خليط تبدو مبهمة. يصب الخليط على "سيد".
9. دي فقاعة في فراغ الغرفة
لإزالة فقاعات ، ويوضع الخليط الماجستير والتي تغطي PDMS قبل ان تتحول الى فراغ الغرفة حتى تختفي جميع الفقاعات.
10. الخبز في الفرن
أخبز لمدة لا تقل عن 12 ساعة في الفرن عند 65 درجة مئوية إلى تصلب PDMS.
11. لكمة ثقوب
انزع PDMS من الماجستير والثقوب لكمة لمداخل ومنافذ للقنوات.
في غرف الأبحاث (لا يظهر)
12. البلازما الرابطة
مستعبدين القنوات لشريحة زجاجية بعد معالجة كل طبقة PDMS وشريحة زجاجية مع البلازما الأكسجين لمدة 1 دقيقة.
التجارب :
إكسب # 1 : التحقيق في استجابة الكيميائي من الجراثيم البحرية على النطاق الصغير طبقات المغذيات
1) إعداد التجربة
- إضافة إلى الكائنات الحية وركائز الزجاج المحاقن
- مكان قناة ميكروفلويديك على مرحلة المجهر ونعلق أنابيب لمداخل ومنافذ مناسبة
- توصيل الأنابيب إلى خزان النفايات. تأكد من أنابيب مغمورة تماما في السائل في خزان النفايات لتجنب التذبذبات الضغط
- مكان الحقن على ضخ حقنة والاتصال صمامات وأنابيب
- إعداد المجهر : ظروف الإضاءة ، التكبير ، الخ.
- التركيز على الموقف المناسب في القناة
- دي فقاعة قناة باستخدام أكبر حقنة مليئة بمياه البحر الاصطناعي
- مجموعة مناسبة معدل التدفق على ضخ حقنة. في هذه الحالة 2 مل / دقيقة ، والتي تتطابق مع سرعة تدفق يعني -1 220 ميكرومتر ليالي في القناة
2) تشغيل التجربة
- بدء ضخ حقنة لإنشاء معامل المواد الغذائية في القناة
- مرة واحدة واستقر تدفق مجموعة من المواد المغذية قد وضعت ، ووقف تدفق على ضخ حقنة وبدء تسجيل الوقت من هذه النقطة
- الفرقة المغذيات يبدأ منتشر أفقيا
- على فترات زمنية منتظمة ، واستخدام برمجيات تحليل الصور لتسجيل تسلسل الإطارات لإنشاء "الأفلام"
- تميز الكائنات السباحة من خلال اتخاذ الوقت الفرق بين الصور إطارين لاحقة ، بحيث الكائنات فقط تتحرك الآن تصور ، مما يسمح لنا للتمييز الخلايا متحركة من غير تحريك الجسيمات والضوضاء في الخلفية
- أفلام اتخاذ مواقف لتحديد الخلايا في القناة مع الإشارة إلى عosition من التصحيح المغذيات
- تسجيل الأفلام على فترات منتظمة لمدة 10-20 دقيقة لتحليل المواقف وأنماط السباحة من الكائنات الحية
- باستخدام برنامج تحليل الصور إلى فرض المواقف من الكائنات الحية في أطر مختلفة (تكليف كل بكسل شدة الضوء القصوى المسجلة في ذلك بكسل على مدى مدة الفيلم) ، يمكننا الحصول على معلومات عن مسار الخلايا السباحة
إكسب # 2 : التحقيق في الآثار المترتبة على القص على البكتيريا البحرية السباحة في vortexZ
- باستخدام هندسة قناة مختلفة ، يمكن أن نلاحظ سلوك البكتيريا تسبح في دوامة بمعدلات مختلفة القص
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فهم كيف تتفاعل مع الجراثيم البحرية الكيماوية المحلية والبيئة المادية أمر حتمي لتصور أكثر اكتمالا والدقيق للدور الكائنات الدقيقة في العوالق المغذيات المحيطات ودورات الكربون (عزام وMalfatti 2007). ومع ذلك ، ونظرا لجداول صغيرة (<ملم) على كثير من التفاعلات التي تجري الميكروبية الهامة ، والقيود الفنية حالت الفحوص الجرثومية التفصيلية للسلوك داخل المشهد الحيوي الفيزيائية والكيميائية غير المتجانسة المتوقع أن يكونوا من ذوي الخبرة عن طريق الميكروبات السباحة في المحيط. وقد مكنت التطورات الأخيرة في على microfluidics (ايتسايدز وآخرون 2001) تحليلات مفصلة للإيكولوجيا الميكروبية داخل microhabitats المعقدة (ماو وآخرون 2003 ، وحديقة وآخرون 2003 ، Keymer وآخرون 2006 ، وماركوس وستوكر 2006). وصفت أجهزة ميكروفلويديك هنا سمح لنا لدراسة كل من استجابة الكيميائي من الميكروبات البحرية لنزع فتيل التصحيح المغذيات (بلاكبيرن وآخرون ، 1997 ، 1998) وسلوك السباحة الميكروبات داخل القص المضطربة ، على مستوى خلية واحدة.
لينة عملية تلفيق يثوغرافية تشارك في جعل قنوات ميكروفلويديك يسمح لمزيد من التفاصيل المعقدة ليتم إنشاؤه داخل العمارة القناة ، التي تسمح بالتحكم الدقيق في التدفقات والتدرجات داخل القنوات. المرونة التي تتيحها تقنية تصنيع يسمح للقنوات ذات أبعاد مختلفة ليتم إنشاؤه للدراسات المقارنة. تطبيق نظام تحليل الصور تصاريح هنا التصور الخلايا الفردية والتدرجات المواد الغذائية ، وتوفير منبر للتحليل الكمي مفصلة السباحة الميكروبية والسلوك الكيميائي للخلية واحدة في كل واحد في ومستوى السكان.
لقد طبقنا هذه القناة ميكروفلويديك باعتباره فحص الكيميائي حساسة لمجموعة متنوعة من الجراثيم البحرية والسباحة وجدت أن العديد من الأنواع قادرة على الاستجابة بسرعة لتصحيح نشرها من العناصر الغذائية ، وتشكيل تجمعات كثيفة من الخلايا داخل تركيزات عالية من المواد الغذائية داخل التصحيح. خلال تراكم الكيميائي للخلايا داخل رقعة المواد الغذائية ، وبعض الأنواع كما عرضت ملحوظ تحولات سلوكية ، بما في ذلك التغيرات في سرعة السباحة وتحويل التردد. ملاحظاتنا توفير الدعم التجريبي لفرضية أن الميكروبات البحرية يمكن الاستفادة من فترة قصيرة بقع المواد الغذائية في المحيطات والنمو الموائل الهامة.
باستخدام هندسة قناة مختلفة ، ونحن قادرون على توليد microvortices مستقرة على مستويات ذات الصلة لديناميات الجرثومية في البيئة المائية. هذا الإعداد يسمح لنا لمراقبة سلوك البكتيريا السباحة استجابة لمعدلات القص المختلفة. على النقيض من السلوك العشوائي السباحة تحت ظروف تدفق هادئة ، تحت تأثير قوي من القص ، والبكتيريا على السواء اتباع يبسط حقل التدفق وتتماشى معها. هذا الإعداد تقدم معلومات قيمة عن التفاعل بين الكائنات الحية الدقيقة الأساسية وبيئتها الديناميكية السوائل.
في كل من هذه التجارب ، وقد ثبت على microfluidics أن تكون أداة فعالة لدراسة السلوك داخل microhabitats الميكروبية الحيوية. مع تزايد الاعتراف بأهمية ديناميات الميكروبية داخل الموائل الطبيعية ، وتطبيقات جديدة للتكنولوجيا ميكروفلويديك ، نقترح أن اقتران زيادة على microfluidics مع البيئة الميكروبية سيحقق رؤى جديدة مهمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نشكر مايكروسيستمز تكنولوجيا مختبرات في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا على السماح لنا الفيلم جزء من هذا الفيديو في غرفة نظيفة.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope | Microscope | Nikon Instruments | ||
| PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) | Tool | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Syringes (Luer-Lok Tip) | Tool | BD Biosciences | ||
| Fitting Part P-704-01 | Tool | Upchurch Scientific | To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes | |
| Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) | Equipment | Harvard Apparatus | ||
| CCD Camera (PCO 1600) | Equipment | Cook |
References
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
- Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
- Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
- Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
- Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
