Summary
制造微流体通道和内修修补补的营养海景和剪切流内的细菌的游泳行为研究海洋微生物的趋化觅食的习性，他们在实验中实现。
Abstract
浮游的微生物可以利用微型的资源的修补程序，在何种程度上，将有相当大的影响，为海洋trophodynamics和生物地球化学通量。然而，要在海洋营养补丁优势，游泳微生物必须克服身体力量的影响，包括分子扩散和湍流剪，这将限制的修补程序的可用性和细菌的能力找到他们。直到最近，方法上的限制，排除内修修补补的栖息地和现实的小规模流动条件下的微生物行为的直接考试。因此，我们目前的知识关于在海洋中的微生物的行为已经从理论预测采购。为了获得我们已申请了软光刻制造技术，开发微流体装置，这是我们用来创建（一）微型尺寸和扩散的特点有关海洋过程的营养补丁及（ii）微尺度海洋微生物觅食行为的新信息与剪切率对应预计在海洋的旋涡。这些微流体装置允许在异构和动态的海景直接检查的微生物游泳和趋化行为。 epifluorescence相衬显微镜结合使用允许的物理尺寸和营养补丁的扩散特性进行直接检查，同时观察在人口聚集的反应，除了个别微生物的游泳行为。这些实验显示，一些浮游植物，异养菌和phagotrophic原生生物物种，善于寻找和利用很短的时间框架内扩散微尺度资源补丁。我们还表明，中等剪切速率，海洋细菌能够争取自己的流量，并通过他们的环境中游泳。但是，超出阈值高剪切水平，细菌是对齐的剪切流动，并没有从流障碍游泳能力较差。微流体新颖，价格低廉的方法，为水生微生物生态学研究，并且由于其准确地建立切合实际的流场和基板梯度在微尺度的适用性，理想地适用于在互动的最小尺度微生物行为的考试。因此，我们建议微流体代表了获得一个更好地了解海洋中的微生物生态的有价值的工具。
Protocol
制备
1。创建遮罩
使用CAD软件，设计了一个透明度高清晰度印刷的渠道。这将是“面具”。
在洁净室：
2。清洁和烤晶圆
首先，喷出的晶圆与丙酮，然后迅速与甲醇，然后用异丙醇。最后，用氮气干燥晶圆。
在5分钟的烤箱（130℃）烘烤晶圆。
3。涂层的晶圆
晶圆放置在旋转涂布机的中心。倒入一瓶到晶圆光阻（SU - 8）。让我们的SU - 8流和放松〜10秒。打开自旋涂布机和斜加快从0到500 RPM超过5秒;保持在500转10秒;上升超过10秒，最终速度和最终速度保持30秒。最终的速度取决于针对性的涂层厚度，并用SU - 8。的细节，可以发现在 http://www.microchem.com/
4。软烤
晶圆涂层后，烘烤在65 ° C，然后在95 ° C。烘烤时间随有针对性的厚度和光致抗蚀剂的类型。然后，让晶圆在室温下坐了至少5分钟。
5。曝光
晶圆上的面具，暴露在SU - 8手册建议的时间晶圆紫外灯。
6。后曝光烤
晶圆烘烤在65 ° C和95 ° C以下的SU - 8手册的指示。
7。发展晶圆获得的“主人”（模具）
准备充满开发甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的烧杯。晶圆浸泡放入烧杯中，轻轻振荡烧杯，直到未曝光部分的光刻胶被冲走。
在我们的实验室：
8。准备PDMS和倒到晶圆
在10:1的比例进入一个杯子，与固化剂混合的PDMS。搅拌混合均匀：这将产生大量的气泡，使混合物看起来不透明。倒在“大师”的混合物。
9。泡沫在真空室
要除去气泡，放置的掌握和PDMS的混合物，覆盖到一个真空室，直到所有的气泡都没有了。
10。烘烤在烤箱
烘烤至少12小时在65 ° C至变硬的PDMS烤箱。
11。打孔
剥离的PDMS从主渠道的进水口和网点打孔。
在洁净室（未显示）
12。等离子粘接
通道是一个处理后的PDMS层和1分钟的等离子体与氧气的载玻片载玻片保税。
实验：
EXP＃1：研究海洋微生物的趋化反应微观尺度的营养层
1）建立实验
- 添加生物和基板玻璃注射器
- 放置到显微镜下阶段的微流体通道，并附加油管适当的入口和出口
- 连接管废物水库。确保管是完全浸没在流体中的浪费水库，以避免压力振荡
- 广场注射器注射泵上，并连接到阀门和管路
- 显微镜：光照条件下，放大倍数等
- 重点在适当的位置上通道
- 德泡沫通道使用较大的注射器充满人工海水
- 设置适当的流速注射泵。在这种情况下，2毫升/分钟，这相当于一个220微米s - 1时的平均流速通道
2）运行实验
- 启动注射泵，以建立一个通道的营养梯度
- 一旦流量已趋于稳定，并已开发的营养带，停止注射泵的流量和从这点开始录制时间
- 营养乐队开始横向扩散
- 在固定的时间间隔，使用图像分析软件，记录帧序列，以创建“电影”
- 随后的两个帧之间的时间差的图像，使移动的物体是只有现在的可视化，让我们以区别于非移动的粒子和背景噪音的游动细胞歧视游泳生物体
- 以电影的细胞，以确定职位与参考通道的Position的营养补丁
- 在10-20分钟的定期记录影片，以分析生物体的立场和游泳模式
- 通过使用图像分析软件，叠加在不同的帧（分配到每个像素的像素记录在电影期间的最大光强）的生物体的位置，我们可以得到游泳细胞的运动轨迹信息
EXP＃2：调查对海洋细菌的剪切效应，在一个vortexZ游泳
- 使用不同的渠道几何，我们可以观察到的行为在不同的剪切速率在旋涡游泳的细菌
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Discussion
海洋微生物如何与当地的化学和物理环境相互作用的理解是势在必行的浮游微生物在海洋中的养分和碳循环（2007年阿扎姆和Malfatti）中的作用更加完整和准确的的感知。然而，由于许多重要的微生物的相互作用，哪些发生小尺度（毫米），技术上的限制，阻碍内异质景观生物物理化学，微生物行为的详细检查，预计要在海洋中游泳的微生物的经历。在微流体（怀特赛德斯等，2001）的最新进展使微生物生态学的详细分析，在复杂的微生境（毛泽东等人，2003年，公园等。2003年，Keymer等。2006年，马科斯和斯托克2006年）。这里描述的微流体装置让我们来研究海洋微生物的趋化反应的一个扩散营养片（布莱克本等。1997年，1998年）和内紊流剪切微生物的游泳行为，在单细胞水平。
软光刻制造过程涉及在微流体通道，使通道架构内创建的错综复杂的细节，允许精确控制的通道内的流动和梯度。制造技术所提供的灵活性，允许渠道的比较研究创建的各个层面。应用图像分析系统，在这里允许在单个细胞和营养梯度的可视化，微生物游泳和趋化行为的详细定量分析提供一个平台，在单细胞和群体水平。
我们应用此作为一个敏感的趋化检测，各种游泳海洋微生物的微流体通道，并发现许多物种都能够迅速响应的营养物质的扩散补丁，内内补丁的高营养浓度的细胞形成致密的聚合。趋化积累在细胞内的营养补丁，一些物种也表现出显着行为的转变，包括在游泳的速度和旋转频率的变化。我们的意见提供了实验支持的假说，即海洋微生物可利用作为重要的生长栖息地的海洋短命的营养修补程序。
使用不同的渠道几何，我们能够生成相关的规模水生环境中的微生物动力学稳定microvortices。此设置允许我们观察到在不同的剪切速率游泳细菌的行为。相比之下静态流量条件下的随机游动的行为，强烈的剪切的影响下，细菌都遵循简化的流场，并与他们保持一致。此设置上的微生物及其流体动力学环境之间的基本相互作用提供了有价值的见解。
在这些实验中，微流体已被证明是一个有效的工具研究动态小生境内的微生物的行为。随着微生物的动态范围内的自然栖息地，和微流体技术的新应用的重要性日益认识到，我们建议进一步微生物生态学微流体耦合将产生重要的新见解。
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Acknowledgments
我们要感谢让我们电影的一部分，这在洁净室设施的视频，在麻省理工学院微系统技术实验室。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope | Microscope | Nikon Instruments | ||
| PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) | Tool | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Syringes (Luer-Lok Tip) | Tool | BD Biosciences | ||
| Fitting Part P-704-01 | Tool | Upchurch Scientific | To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes | |
| Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) | Equipment | Harvard Apparatus | ||
| CCD Camera (PCO 1600) | Equipment | Cook |
References
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