Summary
De fabricage van microfluïdische kanalen en de uitvoering daarvan in experimenten voor het bestuderen van de chemotactische foerageergedrag van mariene microben in een fragmentarische voedingsstof zeegezicht en het zwemgedrag van de bacteriën in shear stroming worden beschreven.
Abstract
De mate waarin planktonische micro-organismen kunnen exploiteren microschaal bron patches zullen aanzienlijke gevolgen hebben voor oceanische trophodynamics en biogeochemische flux. Echter, om te profiteren van voedingsstoffen plekken in de oceaan, zwemmen microben moeten de invloeden van de fysieke krachten waaronder moleculaire diffusie en turbulente shear, die de beschikbaarheid van patches en het vermogen van bacteriën om ze op te sporen zullen beperken overwinnen. Tot voor kort waren de methodologische beperkingen uitgesloten direct onderzoeken van de microbiële gedrag binnen fragmentarisch habitats en realistische kleinschalige stromingscondities. Vandaar, heeft veel van onze huidige kennis over het gedrag van micro-organismen in de oceaan is verkregen van de theoretische voorspellingen. Om nieuwe informatie op de microbiële foerageergedrag te verkrijgen in de oceaan we hebben toegepast zachte lithografische fabricagetechnieken tot en met 2 microfluïdische apparaten, die we hebben gebruikt voor het maken (i) microschaal voedingsstoffen patches met afmetingen en diffusieve eigenschappen die relevant zijn voor oceanische processen en (ii) microschaal te ontwikkelen draaikolken, met afschuifsnelheden die overeenkomen met de verwachting in de oceaan. Deze microfluïdische apparaten hebben toegestaan een eerste directe onderzoek van microbiële zwemmen en chemotactische gedrag binnen een heterogene en dynamische zeegezicht. Het gecombineerde gebruik van epifluorescentie-en fase-contrast-microscopie mogelijk direct onderzoeken van de fysieke afmetingen en diffusieve kenmerken van voedingsstoffen patches, met inachtneming van de populatie-niveau aggregatieve respons, in aanvulling op het zwembad gedrag van individuele microben. Deze experimenten is gebleken dat sommige soorten fytoplankton, heterotrofe bacteriën en phagotrophic protisten zijn bedreven in het opsporen en de exploitatie van verspreiden microschaal bron vlekken binnen zeer korte tijd frames. We hebben ook aangetoond dat tot afschuifsnelheden matig, mariene bacteriën zijn in staat om de stroming en zwemmen door hun omgeving te vechten op hun eigen beweging. Echter, boven een drempel hoge afschuiving niveau, zijn bacteriën uitgelijnd in de afschuiving stroom en zijn minder in staat om te zwemmen zonder verstoring van de stroom. Microfluidics is een nieuwe en goedkope aanpak voor het bestuderen van levende microbiële ecologie, en door zijn geschiktheid om nauwkeurig het creëren van realistische stroming velden en substraat gradiënten op de microschaal, is ideaal voor de examens van microbieel gedrag op de kleinste schalen van interactie. Wij stellen daarom voor dat microfluidics een waardevol instrument voor het verkrijgen van een beter begrip van de ecologie van micro-organismen in de oceaan vertegenwoordigt.
Protocol
Voorbereiding
1. Maak een masker
Met behulp van een CAD-software, het ontwerp van het kanaal voor hoge resolutie afdrukken op een transparantie. Dit zal de "masker" te zijn.
In de clean room:
2. Schoon en bak de wafer
De eerste, spuiten de wafer met aceton, dan snel met methanol, daarna met isopropanol. Tot slot, droog de wafer met behulp van stikstof.
Bak de wafer in de oven (130 ° C) gedurende 5 minuten.
3. Coaten van de wafer
Plaats de wafer in het midden van de spin-coating machine. Giet fotolak (SU-8) uit de fles op de wafer. Laat de SU-8 flow en te ontspannen voor ~ 10 s. Zet de spin-coater en de helling zijn snelheid tot 0 tot 500 tpm meer dan 5 s; te houden bij 500 rpm gedurende 10 s, oprit tot aan de uiteindelijke snelheid van meer dan 10 s en te handhaven op eindsnelheid voor 30 s. De uiteindelijke snelheid is afhankelijk van de beoogde coating dikte en de SU-8 gebruikt. De details zijn te vinden op http://www.microchem.com/
4. Soft-bakken
Na het coaten van de wafer, bak het eerst bij 65 ° C en vervolgens bij 95 ° C. De baktijd varieert met gerichte dikte en het type van de fotolak wordt gebruikt. Vervolgens laat de wafer op kamertemperatuur zitten voor ten minste 5 minuten.
5. Blootstelling
Plaats het masker op de top van de wafer en bloot de wafer aan UV-licht voor de tijd aanbevolen in de SU-8 handleiding.
6. Post-exposure bakken
Bak de wafer bij 65 ° C en vervolgens 95 ° C naar aanleiding van de SU-8 handleiding de instructies.
7. Ontwikkeling van de wafer aan de "master" (mal) te verkrijgen
Bereid een beker gevuld met de ontwikkelaar (PMMA). Dompel de wafer in de beker, terwijl heel voorzichtig oscillerende de beker tot de niet-belichte deel van de fotoresist is weggespoeld.
In ons lab:
8. Bereid PDMS en giet het op de wafer
Meng de PDMS met de verharder in de 10:01-verhouding in een beker. Roer en meng het homogeen: dit zal genereren veel belletjes en maak het mengsel ondoorzichtige look. Giet het mengsel op de "master".
9. De-bubble in vacuümkamer
Voor het verwijderen van de belletjes, plaatste de meester en PDMS mengsel dat het over in een vacuümkamer totdat alle luchtbellen verdwenen zijn.
10. Bakken in de oven
Bak gedurende minstens 12 uur in een oven op 65 ° C te harden van de PDMS.
11. Gaatjes
Verwijder de PDMS van de meester en punch gaten voor inlaten en uitlaten van de kanalen.
In cleanroom (niet afgebeeld)
12. Plasma bonding
Kanalen worden gebonden aan een glaasje na het behandelen van zowel de PDMS-laag en het glazen schuif met zuurstof plasma gedurende 1 minuut.
Experimenten:
Exp # 1: Onderzoek naar de chemotactische respons van mariene microben op micro-schaal voedingsstoffen lagen
1) Het opzetten van het experiment
- Voeg organismen en substraten op glas spuiten
- Plaats microfluïdische kanaal op microscoop podium en hechten leidingen de juiste in-en uitgangen
- Sluit de slang aan op reservoir afval. Zorg ervoor dat buizen is volledig ondergedompeld in de vloeistof in het afval reservoir om drukschommelingen te vermijden
- Plaats de spuiten op spuitpomp en verbinding maken met kleppen en buizen
- Stel microscoop: lichtomstandigheden, vergroting, etc.
- Focus op juiste positie in het kanaal
- De-bubble kanaal met grotere injectiespuit gevuld met kunstmatig zeewater
- Stel juiste debiet op de injectiepomp. In dit geval 2 ml / min, wat tot een gemiddelde stroomsnelheid van 220 micrometer s -1 overeenkomt met het kanaal
2) Het uitvoeren van de experiment
- Start spuit pomp naar een voedingsstof gradiënt in het kanaal tot stand
- Zodra stroom heeft gestabiliseerd en een band van voedingsstoffen heeft ontwikkeld, stop de doorstroming op de spuit pomp en begint op te nemen tijd vanaf dit punt
- Voedingsstoffen band begint te zijwaarts diffuse
- Op regelmatige tijdstippen gebruik beeldanalyse software om sequenties van frames record 'films' te creëren
- Discrimineren zwemmen organismen door het nemen van time-beelden verschil tussen twee opeenvolgende frames, zodat alleen bewegende objecten nu zichtbaar zijn, waardoor we beweeglijke cellen te onderscheiden van niet-bewegende deeltjes en achtergrondruis
- Neem de films tot posities van cellen in het kanaal aan de hand te bepalen van de pSTANDPUNT van de nutriënt patch
- Films opnemen op regelmatige tijdstippen gedurende 10-20 min om de posities en zwemmen patronen van organismen te analyseren
- Door het gebruik van de beeldanalyse software om de posities van de organismen in verschillende frames (toekennen aan elke pixel de maximale lichtintensiteit opgenomen in die pixel over de duur van de film) over elkaar, kunnen wij traject informatie te verkrijgen om in te zwemmen cellen
Exp # 2: Onderzoek naar de effecten van de afschuiving op mariene bacteriën zwemmen in een vortexZ
- Met behulp van verschillende kanalen geometrie, kunnen we observeren het gedrag van bacteriën zwemmen in een draaikolk bij verschillende afschuifsnelheden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een inzicht in hoe mariene microben interactie met hun lokale chemische en fysieke omgeving is noodzakelijk voor een meer volledige en nauwkeurige perceptie van de rol van de planktonische micro-organismen in de oceanen voedingsstoffen en koolstof cycli (Azam en Malfatti 2007). Echter, vanwege de kleine schaal (<mm) waarover veel belangrijke microbiële interacties plaatsvinden, technische beperkingen hebben verhinderd gedetailleerd onderzoek van microbiële gedrag binnen de heterogene bio-fysisch-chemische landschap voorspeld worden ervaren door te zwemmen microben in de oceaan. Recente ontwikkelingen in microfluidics (Whitesides et al.. 2001) in staat hebben gesteld gedetailleerde analyses van de microbiële ecologie binnen complexe microhabitats (Mao et al.. 2003, Park et al.. 2.003, Keymer et al.. 2.006, Marcos en Stocker 2006). De microfluïdische apparaten die hier beschreven liet ons toe om zowel de chemotactische respons van mariene microben om een verspreiding van voedingsstoffen patch te onderzoeken (Blackburn et al.. 1997, 1998) en het zwemgedrag van microben in turbulente afschuiving, op een enkele cel niveau.
De zachte lithografische fabricage proces betrokken bij het maken van de microfluïdische kanalen maakt het mogelijk ingewikkelde details op te richten binnen het channel architectuur, waardoor de precieze controle van de stromen en gradiënten in de kanalen. Flexibiliteit wordt geboden door de fabricage techniek maakt het mogelijk om kanalen van verschillende afmetingen worden gemaakt voor vergelijkende studies. Het beeldanalyse systeem toegepast hier maakt de visualisatie van de individuele cellen en voedingsstoffen gradiënten, een platform te bieden voor de gedetailleerde kwantitatieve analyse van microbiële zwemmen en chemotactische gedrag bij zowel een single-cell en populatie niveau.
We hebben toegepast dit microfluïdische kanaal als een gevoelige chemotaxis test voor een verscheidenheid van zwemmen mariene microben en hebben geconstateerd dat veel soorten in staat zijn snel te reageren op een diffuse patch van voedingsstoffen, de vorming van grote concentraties van cellen in de hoge concentraties nutriënten in de patch. Tijdens de chemotactische accumulatie van cellen in de voedingsstof patch, hebben sommige soorten ook tentoongesteld gemarkeerd gedrag verschuivingen, met inbegrip van veranderingen in de zwemsnelheid en draaien frequentie. Onze waarnemingen bieden experimentele ondersteuning voor de hypothese dat mariene microben kan van korte duur voedingsstoffen vlekken te gebruiken in de oceaan als belangrijke groei habitats.
Met behulp van verschillende kanalen geometrie, zijn wij in staat om een stabiele microvortices op schalen die relevant zijn voor microbiële dynamiek in het aquatisch milieu te genereren. Deze opstelling stelt ons in staat om het gedrag van bacteriën zwemmen observeren in reactie op verschillende afschuifsnelheden. In tegenstelling tot de willekeurige zwemgedrag onder stroom rust toestand, onder invloed van een sterke shear, bacteriën volgen zowel stroomlijnt van het stromingsveld en zijn afgestemd met hen. Deze opzet biedt een waardevol inzicht in de fundamentele wisselwerking tussen micro-organismen en hun vocht dynamische omgeving.
In elk van deze experimenten heeft microfluidics bewezen een effectief instrument voor het bestuderen van microbiële gedrag binnen dynamische microhabitats worden. Met een toenemende erkenning van het belang van microbiële dynamiek binnen de natuurlijke habitats, en nieuwe toepassingen van microfluïdische technologie, raden we aan dat de verdere koppeling van microfluidics met microbiële ecologie zullen belangrijke nieuwe inzichten opleveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag Microsystems Technology Laboratories bij MIT bedanken voor het toestaan van ons om film deel uit van deze video in de clean room faciliteit.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope | Microscope | Nikon Instruments | ||
| PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) | Tool | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Syringes (Luer-Lok Tip) | Tool | BD Biosciences | ||
| Fitting Part P-704-01 | Tool | Upchurch Scientific | To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes | |
| Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) | Equipment | Harvard Apparatus | ||
| CCD Camera (PCO 1600) | Equipment | Cook |
References
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
- Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
- Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
- Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
- Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
